结核分枝杆菌的核检测.pptVIP

标本采集：肝素或柠檬酸钠抗凝的外周静脉血 分离单个核细胞，每个检测孔含有25万个细胞。每个检测标本分4个孔：空白对照，阳性对照，两个样本孔 37℃孵育16-20个小时 洗涤-抗体孵育1h-洗涤-显色-计数蓝色斑点 阴性结果：患者体内不存在结核杆菌特异的效应T细胞；排除结核感染（包括排除肺外结核感染） 阳性结果：患者存在结核感染，但是不能区别是否为活动性结核病。 结核分枝杆菌核酸及血清学检测 唐媛媛 潍坊市第二人民医院 检验科 结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸序列； 阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝杆菌。 结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等 结核分枝杆菌核酸检测 增加分子生物学阳性可以作为确诊标准，及强调病原学检查的重要性。 3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。以病原学、病理学结果作为确诊依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影像学检查支持即可确诊。 常用技术 传统实时荧光定量PCR检测 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 环介导等温扩增检测 实时荧光核酸恒温扩增检测 交叉引物恒温扩增检测 基因探针检测 抗酸染色 每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一 荧光染色 1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB 1.假阳性率高 2.结合抗酸染色 结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果 2014年WHO关于结核诊断的标准 肺结核 所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行诊断 耐药结核 当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重时，应使用Xpert MTB/RIF做初始诊断； 肺外结核 所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF 做初始诊断 GeneXpert Xpert MTB/RIF 一种半巢式实时荧光PCR体外诊断技术，可以检测结核分枝杆菌以及利福平耐药性； 针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物、探针。5个探针结合到野生型，而不是突变体目标。每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。 痰标本与处理液 1：2混合 吸取2ml处理样品 到反应盒 将反应盒放入检测模块（手工操作完成） 标本自动 清洗过滤 超声裂解 DNA提纯 DNA和PCR反应试剂混合 半巢式实时荧光定量核酸扩增检测 打印检测报告 获得检测结果时间：1小时50分钟 系统内自动完成 INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。? 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。 Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46. MTB/RIF检测对MDR-TB的防控 “结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。 环介导等温扩增仪（TB-LAMP） 体外定性检测结核分枝杆菌复合群； 在恒温条件下进行基因扩增反应； 4种引物识别6个区域，特异性高； 扩增反应效率高，67℃，40min。 主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较小，而且试剂成本较低。 传统实时荧光定量PCR检测 目的：定量检测人标本中的结核分枝杆菌核酸 原理：PCR反应体系中加入