目的基因进入受体细胞.PPTVIP

基因的结构 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 启动子 原核 真核 终止子 二者的区别是？ 思考？ 某同学从人的基因组文库中获得了 胰岛素基因，以大肠杆菌作为受体细胞 却未得到胰岛素，其原因是什么？ 真核生物基因中通常有内含子，而原核生物 基因中没有，大肠杆菌是原核生物，它没有 真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，所以不能合成相应物质。 思考？ 若受体细胞是大肠杆菌，应从哪种基因文库中获取胰岛素基因呢？为什么？ 真核细胞的cDNA的获取 编码区 非编码区 非编码区 DNA聚合酶 剪接有关的酶 RNA聚合酶 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 逆转录酶 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码序列。即不含非编码区和内含子 思考？ 基因组文库与cDNA文库的区别有哪些呢？ 基因组文库与cDNA文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中是否含启动子 基因中是否含内含子 基因多少 物种间的基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 2.利用PCR技术扩增胰岛素基因 1、PCR过程中需要解旋酶吗？ 所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 2、 PCR技术的原理是什么？条件有哪些？ 需要加能量吗？ 原理：DNA复制 条件：模板DNA；引物；dNTP；热稳定DNA聚合酶 dNTP变为脱氧核苷酸过程中，脱去磷酸基团，释放高能磷酸键中的能量 3、前提条件是什么？ 前提： 已知胰岛素基因的一段核苷酸序列 过程 变性、复性、延伸三步曲 变性：加热至90～95℃双链DNA解旋成为单链DNA 复性：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA相配对和结合 延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板， 合成互补的新DNA链 变性 复性 延伸 思考：此过程中需 不断加入的是什么？什么可以重复利用？ 原料和引物 热稳定DNA聚合酶 引物设计主要遵循的原则： （1）引物的长度一般在15-30bP，太短则 特异性不够强，太长则退火温度会比较高 （2）引物G+C含量以40%-60%为宜，太少扩增 效果不佳，过多易出现非特异条带，4种碱基 最好随机分布 （3）两条引物之间不能有连续4个碱基的 互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于 得不到目的基因片段 3. 人工合成法合成胰岛素基因 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成 胰岛素的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的核苷酸序列 胰岛素基因 化学合成 推测 推测 思考：化学法人工合成的胰岛素基因含内含子、启动子和终止子吗？ 基因表达载体的构建 —基因工程的核心 构建胰岛素基因表达载体需要用到哪些工具？ 关键步骤二： （一）、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 来源：限制性核酸内切酶，又称限制酶 主要从原核生物中分离纯化。 1 2 3 作用特点：识别特定核苷酸序列，使每条链中 特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 作用结果：产生黏性末端或平末端。 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 为什么切割目的基因和载体要选用同一种限制性核酸内切酶？ 获得相同的黏性(平)末端 思考? 在实际的基因工程操作时往往用两种限制性 核酸内切酶分别切割目的基因的两端以及载体， 这样做有什么好处？ 防止目的基因、载体自我环化以保证二者正向连接 (二）、“分子缝合针” —— DNA连接酶 1 种类 ：⑴ E·coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶 2 作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键。 3.连接酶类型总结 类型 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 (三)、“分子运输车” ——基因进入受体细胞的载体 ⒈载体需要的条件： ⑴有1~多个限制酶切点供外源基因插入 ⑵有某些标记基因，便于筛选含目的基因的细胞 ⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达 ⑷对受体细胞无害 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？载体需具备哪些条件？常用运载体有哪些？ ⒉常用运载体： 　 ⑴细菌的质粒 　 ⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒 ①基因表达载体的组成？ ②用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？ ?能否将目的基因插入载体的标记基因中