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实验二：酶活力测定方法的研究 生物093 孙文雅 0902040319 一、研究背景 酶是生物体维持各种生命活动的重要物质，它是生物体内各种代谢反应的催化剂，在所有生物体的生命活动中起着至关重要的作用。酶能够在十分温和的条件下，快速高效率地催化各种生化反应，维持机体的正常生命活动。生物体中存在许多种的酶，每一种酶都有它特异的作用对象，即具有专一性，这是由于各种酶的反应条件及作用机理都不相同。 要进行酶活力的测定，我们首先要明确的即是该酶在生物体内保持最大催化活性的生化反应条件。在体外进行酶活力测定要针对酶的特异性进行， 我们对于不同酶的测定方法势必会有很大差异，那么该如何对某种酶活力的测定进行具体细节的设计与分析呢？除去反应条件的控制外，具体材料的选择及具体操作步骤的设计上上是否要遵循同一准则呢？在进行同一种酶在不同的材料中、不同发育时期的活力测定时，测定方法是否可以生搬硬套呢？如果不是，又该如何把握具体细节的设计与修正呢？这些具体细节的把握又是以何为依据的呢？这些疑问都需要我们在实验中进行深入的探讨与研究。 本次实验主要以淀粉酶与转氨酶的活力为主要测定对象，希望能从中寻找到对于上述疑问的解答思路。而实验前我们首先需要了解及准备的则是淀粉酶的性质、最适反应条件及作用机理。 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶、β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，广泛存在于禾谷类的种子中。休眠的种子中只有β-淀粉酶存在，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。α-淀粉酶是内切酶，它可以水解淀粉内部任何部位的α-1,4-糖苷键；β-淀粉酶是外切酶，它只能从淀粉的非还原末端依次水解一个个麦芽二糖，但它不能越过已经存在的α-1,6-糖苷键继续切割；这两种酶的最终产物均主要为麦芽糖。在性质方面，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化，而β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，因此在测定过程中，若两种酶同时存在，可利用这两种酶的不同性质加以处理，钝化其一，即可单独测定另一种酶的活性。 研究目标 在把握实验总体设计思路的基础上，通过对淀粉酶活力测定实验的具体操作设计，以我们比较熟悉的禾谷类种子的萌发状态及其代谢特点为具体研究对象，依照我们借助于前人的成果所设计的实验具体方案，进行淀粉酶活力的测定，体会分析具体测定细节设计上的差异，并对获得的结果进行深入的分析探讨，修正并认可该实验的具体设计方案，从而获取相关设计理念并完成酶活力测定实验操作的训练。 研究策略 首先从理论上对两种淀粉酶的性质及催化原理进行了解、对比，找到两种酶催化的最适条件（温度、pH等），并通过对两种酶性质的探讨，明确如何在两种酶同时存在的前提下只测定其中一种酶活力的控制方法，以及如何通过实验测定结果反映出酶催化活力的大小。 催化机理 产物 钝化条件 α-淀粉酶 内切酶，可以水解淀粉内部任何部位的α-1,4-糖苷键 α-极限糊精、麦芽糖、葡萄糖 pH3.6以下 β-淀粉酶 外切酶，从淀粉的非还原末端依次水解一个个麦芽二糖，但不能越过已经存在的α-1,6-糖苷键继续切割 β-极限糊精、麦芽糖 高温（70℃下维持15min） 在明确α-淀粉酶与β-淀粉酶特性的基础上，选择理论上操作最方便可行的处理方法，即选择β-淀粉酶进行钝化，测定α-淀粉酶的活力及两种酶总的催化活力。之所以认为这种方法是最方便可行的，有以下原因：倘若选择使两种酶分别钝化的方式单独测定另一种酶的活力，在对酶液的处理上势必会增加一些额外的工作量，而且我们也不能保证两种处理方法是否会对另一种酶造成不必要的损失；而只对一种酶进行钝化处理则可避免工作量的加大，缩短实验时间，避免了酶液长期放置可能会对酶活力造成的影响，当然这是在假设两种酶的活力不会互相影响的前提下的最好选择，但如果最终实验结果的分析表明，两种酶存在相互作用的话，我们就不得不分别对两种酶进行测定了；另外，控制温度比控制溶液的pH值要容易得多，这也是我们选择使β-淀粉酶而非α-淀粉酶钝化的原因。 设计具体的实验操作方案，注意对酶进行处理的实验条件的控制及缓冲液的选择，并通过光电比色法对共同产物（麦芽糖）含量的测定衡量酶催化活力的大小。在这里，根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）。 记录实验数据，计算分析两种淀粉酶的活力，并判断实验方案的可行性。 研究方案及可行性分析 1、该实验的理论基础是：在某种条件下，给予一定的条件，单独或同时测定某种或某些酶催化产物的含量来反映酶的催化活力。实验中需要进行待测酶液的制备、控制反应条件对某种酶进行钝化处理及使酶在保持最大活力下对底物进行催化反应、