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现代细胞分子生物学研究方法吴 乔Add：生物馆II 322Tel：2187959qiaow@2010.9 基因研究的各种方法 Northern blotting关键点：DNA探针，标记试剂盒（同位素和非同位素）；设内标；优点：特异性和敏感性高缺点：实验繁琐，同位素  RT-PCR RT-PCR主要由两大步骤组成，一是反转录（RT），二是PCR。它与普通PCR的区别就在于它是以mRNA为最初始的模板。 RT-PCR的用途很广泛，既可以用来构建cDNA文库，也可以获得感兴趣的基因的cDNA序列。如果以内源的一些参照为标准，还可以用于研究细胞内特定基因的mRNA的表达水平。 关键点：mRNA，相关引物， PCR仪 不足：只能相对定量，不能 绝对定量 Real-time PCR 实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种新的基因定量检测技术，它通过PCR扩增中Tag酶的5’－3’的核酸外切酶活性，可以将标记在探针上的荧光基团一淬灭基团分离，使荧光基团脱离淬灭基团的控制，从而产生荧光发射。通过荧光吸收装置检测发出荧光的多少来反映模板量的高低，从而达到实时定量的目的。 关键点：引物设计，real-time PCR仪 原位杂交定位基因的表达 1， 组织/细胞固定脱水石蜡包埋切片 2，DNA 探针的制备（地高辛或同位素标记） 3，探针标记mRNA显示mRNA 4，显微镜观察 关键点：相应的DNA 探针；地高辛试剂盒或同位素，切片机；对照组的设置 RNA干扰技术 发现者获得诺贝尔奖； RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种可以在细胞内抑制特定基因表达的现象。它由双链RNA产生，可以特异性地降解具有相同或者相似序列的RNA（包括mRNA）。它是一种比反义技术更为有效的方法，具有更高的特异性。 基因转录活性的检测（荧光素酶检测方法） 荧光酶基因（Luc）是从萤火虫cDNA文库中克隆的 哺乳动物细胞和组织没有任何内源性荧光素酶活力，所以Luc可作为非常灵敏的遗传报告基因 荧光酶报告基因具有检测速度快、灵敏度高、费用低、用途广、可定量等优点 基因转录活性的检测（荧光素酶检测方法） 基因芯片分析 设置好对照组，取样（mRNA） 由公司测定，提供基因检测结果（根据细胞功能分类） 排除变化相同的基因 确定变化差异的基因 选择感兴趣的基因进一步证实它们的变化 该方法特别适合用于信号通路中新的下游靶基因的发现 蛋白研究的各种方法 Western blotting关键点：相应的抗体；ECL显示试剂；设内标； 不同抗体差别很大：用量、效果、特异性 使用的电泳胶的浓度与蛋白的分子量密切相关  （反比关系）优点：可用于定量分析 蛋白半衰期 免疫组织化学方法显示蛋白 蛋白的相互作用和蛋白与DNA的结合分析 免疫沉淀/免疫印迹(Co-IP)Immunoprecipitation/Western blot 用特异性抗体结合细胞裂解液中的某个目的蛋白质（即免疫沉淀），洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），最后用Western blot 分析显示另一个目的蛋白质。这种方法可以分析溶液中、细胞内的相互作用蛋白，但只能是定性或半定量的实验。 BIAcore生物分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Analysis） 基于表面等离子体共振（SPR）来实时跟踪生物分子间的相互作用的技术。 被广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。 具有高天然性、高效率、高灵敏度、样品量少、应用广泛等优点，但仪器昂贵、不易操作、价格高。 凝胶阻抑实验（Gel retardation assay） 当DNA结合蛋白与相应的DNA片段或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速率慢得多，在X光胶片上形成一较游离DNA片段滞后的带型。 染色质免疫共沉淀（ChIP） 利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内蛋白与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与基因芯片相结合建立的Ch