细胞工程第5章.pptVIP

第一节 细胞融合及其方法 ◆ 体外细胞的自发融合 小鼠和鸡成肌细胞的融合：可在原代培养中观察到，只有处于G1期的成肌细胞才能彼此发生融合。 肿瘤细胞的融合：体外培养的肿瘤细胞和体内一样彼此发生融合。 （二） 诱导细胞融合 ◆1962年日本学者发现日本血凝性病毒引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。 ◆ 20世纪70年代初，高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合。 ◆ 20世纪80年代，齐默曼等建立电场诱导细胞融合方法。 1、生物法 病毒诱导细胞融合：主要是由于病毒附着在宿主细胞膜上起搭桥作用，细胞聚集在一起，黏结部位质膜被破坏，细胞间形成通道，病毒同时进入两个细胞打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。 病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 机制主要是病毒表面刺突的神经氨酸酶的作用。当病毒位于两个细胞之间时，神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在高pH和Ca+条件下局部细胞膜发生融合。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 2、化学法 ◆可以采用的化学诱导剂包括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体 、植物凝血素、伴刀豆球蛋白A等。 ◆细胞膜电荷平衡被打破。 聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物。PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。 当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。 在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。因此，PEG结合高pH、高浓度Ca2+诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。 优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 3、物理法 电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合。 原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点：融合率高，重复性与可控制性强 。 缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。 筛选的基本原理是通过培养和筛选，把融合体从同核体以及未发生融合的两种亲本细胞中分离出来。 筛选的方法 ◆非选择性筛选：利用杂交细胞生长比亲本细胞快的现象，用机械的方法（如毛细管吸取法）把单个杂交细胞挑选出来，分裂繁殖，培养出细胞克隆。 ◆选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营养要求或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。 常用方法有：抗药性筛选；营养缺陷型筛选；温度敏感型筛选等。 四、动物细胞融合的应用 1、突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、 人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡等。 2、成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。 3、为制造单克隆抗体开辟了新途径。 二、杂交瘤技术(hybridoma technology）定义 用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)。杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，通过克隆化培养获得纯的细胞可以生产高纯度的单克隆抗体。 一般要经过初次免疫、第二次免疫(向动物腹腔内注射抗体)、加强免疫(向动物静脉内注射抗体)三个过程。 一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 ◆骨髓瘤细胞的获得 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。 将不完全培养基加入融合细