western blot原理及操作方法.pptVIP

Western blot 原理 分类 主要试剂 操作步骤 常见问题 原理 Western?Blot（蛋白免疫印迹）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 。 抗原 一抗 生物素标记 的二抗 ECL发光试剂 分类 SDS（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳） native（非变性聚丙烯酰胺凝胶） 区别在于加不加变性剂（比如SDS）使蛋白质变性，SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量 主要试剂 1.ddH2O 2.30% 丙烯酰胺混合液 ? 丙烯酰胺(arc)29g和N，N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)1g加H2O至100ml。储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月