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（一）质粒的生物学特性 ⑹ 质粒的转移???????????? ???????????????????????? （二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。 （三）质粒载体的改造 ⑴去掉不必要的DNA区段。 ⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。 ⑶加入易于捡出的选择性标记基因。 ⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。 ⑸改造或增加基因表达的调控序列。 1、质粒pBR322 pBR322质粒的优点： （1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6×106Da， （2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。 （4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。 外源DNA 2、pUC质粒载体 1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化 （3） LacZ′基因 编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。 （4）MCS区段 2、pUC质粒载体 与pBR322相比， pUC质粒载体优点： （1）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝 （2）适用于组织化学法检测重组体 通过?-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。 （3）具有多克隆位点区段（MCS） 可以定向克隆防止载体自我连接。 2. ?噬菌体的生物学特性 ⑵是一个温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 ⑶复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 ⑷基因组成 ?DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶—1970年，H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 平齐末端 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. DNA 连接酶连接的作用机制 ⑴ E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN ⑵ E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E ⑶ DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 （四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。 3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。 4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。 Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性） ⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 ⑵标记DNA片段的末端 底物用［α－32P］－dNTPs ⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成 ⑷DNA序列的测定 其主要用途有： ⑴　在cDNA合成过程中，切开cD