10实验十 PCR基因扩增及PAGE电泳检测.pptVIP

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 在混合样品中各组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 (三) 安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式 垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。 主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。 玻板的清洗方法 抽真空、注胶及胶凝聚前注意事项 制胶、注胶 水 甘油 30%丙烯酰胺（29：1） 5×TBE 10%过硫酸铵 TEMED（注胶前加入混匀） 注胶后静置60min聚合 57.7-62.7 mL 0-5 16.6 20 0.7mL 35 μL /100mL 5%，100mL胶液配方 (四)样品处理及加样 一般加样体积为10－15uL如样品较稀，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 (五) 电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，将电压调至1—8V/cm。当溴酚兰染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中。 １．记录观察到的结果。 ２．分析电泳条带的分布。 * * 实验十、 PCR基因扩增及PAGE电泳检测 实验学时：6 学时 实验类型：综合性 每组人数： 4 人／组 一、实验目的 1、掌握PCR扩增目的基因的原理。 2、通过本实验学习PCR扩增目的基因的方法。 3、掌握聚丙烯酰胺凝胶配制方法和电泳检测DNA的方法。 ?二、实验原理? 1. 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。以人工合成的与待扩增DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸短序列为引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可将目的DNA扩增上百万倍。 5’ 3’ 3’ 5’ 高温变性 低温退火 中温延伸 循环 聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图 目的片段 模板 引物对 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后模板DNA可扩增10 6 ~ 10 9倍。 三、仪器、材料与试剂 (一)仪器 1．PCR仪 2．垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50μl或100μl微量注射器 (二)材料 1．DNA模板： 2．4种dNTP， 3．引物1、引物2 4．Taq酶（或Pfu酶） 5．PCR buffer 6．PAGE 凝胶 贮液 7. DNA分子量标准物（DL15000） (三)试剂 1．5x缓冲液（注意：Taq酶与Pfu酶的不同） 2．4×dNTP 1mmo1／L dATP 1mmo1／L dCTP 1mmo1／L dGTP 1mmo1／L dTTP 3．Taq酶（或Pfu酶） 10U／uL 4．DNA模板 1ng／uL 5．引物1、引物2（引物溶液浓度1pmol/uL） 四、实验步骤： (一)在0.2mL PCR小管内配制20μL反应体系: ddH20 4.5 μL  5×PCR缓冲液 4 4×dNTP 1mM 2 引物1 1μM 4 引物2 1μM 4 模板DNA 1 Taq酶 0.5 20 μL  注意:操作中加药品的顺序。 30个循环 (二)按下述程序进行扩增: （如扩增程序编号0000000566）  ①94℃预变性5 min； ②94℃变性 30 Sec ③58℃退火 30 Sec