酶工程2中国药科大学生物工程所有课件.pptVIP

酶分子的化学修饰 刘俊 liujun0929@ 酶在实际应用中有局限性 1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解； 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验， 半衰期短、易变性失活； 3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。 一、 酶分子的化学修饰概念及其作用（一级结构水平的改造） 酶的化学修饰，就是在分子水平上对酶的化学结构进行改变，以达到改构和改性的目的（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联） 。 达到： 改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求） 提高酶的稳定性 扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用） 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。 在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长 它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性 和抗原性。 在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱 和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学 性质。 在酶结构功能研究中： 1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究； 2.确定氨基酸残基的功能； 3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。 决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。 选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性 三、酶分子化学修饰的主要方法 （一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰 （一）酶分子的主链修饰 概念：将酶分子的主链切断或者连接，从而使酶分子的化学结构及其空间结构发生变化，进而改变酶的特性和功能的方法。 1 主链的切断修饰 通过肽酶等手段切断。比较切断前后，酶活性的变化，从而探索酶活性中心的位置及主链不同位置对酶活性的影响。 2 主链的连接修饰 通过基因融合技术将两种或两种以上的酶基因融在一起。 （二）酶分子的侧链基团修饰 概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。 选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。 侧链基团修饰的主要作用 1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性质和数目。 2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定 3.探索酶蛋白作用的化学机理 4.用于酶蛋白分子的固定化 （三）酶分子的化学交联修饰 概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可以在分子与分子之间。 即酶分子的固定化。 同型 双亚氨酯 氨基 双功能试剂 异型 碳二亚胺 氨基和羧基 光活化 碳烯或氮烯 分子内交联 增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。 分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。 （四）酶分子的大分子修饰 概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应 根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。 （1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物。多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。 （2）大分子共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层覆盖层。 （五）酶分子的亲和标记修饰 概念：可以与酶分子的活性部位发生特异性结合，并且修饰剂的活性基团可以与酶分子的活性部位的侧链基团发生反应，形成共价键，也可以称为酶分子的亲和标记。 亲和试剂可以专一性地标记于酶