控制菌检查资料.doc

控制菌检查 1 方法的验证 在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时，按各供试品微生物限度项下的规定（给药途径）选择相应的菌株，并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。 2 仪器、设备及用具 见各控制菌检查项下。 3 试液、指示液 见各控制菌检查项下。 5 验证用菌株及菌液制备 5.1 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]。 乙型副伤寒沙门菌（Salmonellaparatyphi-B）[CMCC（B）50094]。 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]。 生孢梭菌（Clostridiumsporogenoes）[CMCC（B）64941]。 5.2 菌液制备 分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基内，置36℃±1℃培养18～24h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。 6 供试液的制备[见细菌、霉菌和酵母菌计数7]。 7 验证方法 7.1 试验组 取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为试验菌。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接种到增菌培养基中。 7.2 阴性对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌：验证铜绿单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 8 结果判定 阴性对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应参照细菌、霉菌和酵母菌计数7.8具抑菌活性的供试品项下操作，以消除供试品的抑菌活性。建立新的方法，并重新验证。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 （一）大肠埃希菌 1 简述 大肠埃希菌（Escherichia coli）即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排除体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 用4-甲基伞形酮葡萄糖苷（4-Methylumbelliferyl-β-Dglucuronide, MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10%的山门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 2 仪器、设备及用具 2.1 无菌室[参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.1.1]。 2.2 净化工作台。 2.3 培养箱（36℃±1℃）。 2.4 高压蒸汽灭菌器。 2.5 显微镜（1500×）。 2.6 微波炉。 2.7 恒温水浴（45℃±1℃）。 2.8 离心机（500～4000r/min）。 2.9 0.45μm±0.