分子诊断生物大分子分离纯化.pptVIP

第三章 生物大分子的分离纯化;;;本章内容提要;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;DNA病毒 ;;一、材料与方法的选择;;;保持核酸的完整性 整个操作过程中尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 物理：剪切力、高温 0-4℃ 化学：酸、碱、有机溶剂 pH4-10 生物学：DNase及RNase 不可避免的有害因素要采取措施尽量减轻对核酸的破坏 简化提取纯化步骤、缩短分离时间，避免剧烈震荡； 加入金属离子螯合剂抑制DNase活性，加入DEPC (二乙基焦碳酸盐) 抑制RNase活性 细胞应完整，相关器皿及试剂应提前消毒;二、技术路线的设计;;;核酸的有机溶剂沉淀法的原理 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，当加入一定浓度的盐后，核酸分子与1价或2价阳离子形成盐，通过屏蔽带负电荷的磷酸基团，使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂，此外，这些盐在许多有机溶剂中亦不溶解，也不会被有机溶剂变性，因此常在加入一定浓度的盐后，用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸。 常用的盐类有NaAc、 KAc 、NH4Ac、 MgCl2 、KCl、NaCl 常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。