过氧化物酶染色Washburn法骨髓巨核细胞计数作业指导书.doc

过氧化物酶染色Washburn法骨髓巨核细胞计数作业指导书 1. 实验原理 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。 2. 标本采集 2.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。 2.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液 2.3 标本采集要求 2.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。 2.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。 3. 标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。 4. 标本运输：室温运输 5. 标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。 6. 试剂 6.1 试剂名称：血细胞pox染色试剂 6.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司 6.3 试剂组成 试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。 试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。 试剂3：95％乙醇，室温避光保存。 试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。 7. 操作步骤 7.1 新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。 7.2 滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。 8. 结果判断 8.1 阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。 8.2 阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。 9. 临床意义 9.1 粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。 9.2 淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。 10. 操作性能：快速简便，特异性强，灵敏度高。 11. 方法局限性 11.1 标本应新鲜，且未受其他化学物的污染。若标本采集后不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟后，可保存数天。 11.2 双氧水（Ⅱ液）最适浓度为0.05mol/L左右，浓度过高，将会抑制酶的活性。 12. 参考文献 谭齐贤主编﹒临床血液学和血液检验﹒人民卫生出版社，2002，北京：46-47