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有关核酸提取与鉴定的最基本实验 细菌质粒DNA的提取与纯化 细菌质粒DNA的提取与纯化（碱裂解法） 1）将细菌沉淀，所得重悬于100μL用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。 　　溶液I 　　50mmol/L葡萄糖 　　25mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 　　10mmol/L EDTA（pH8.0） 　　溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa） 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。 碱裂解法提取细菌质粒DNA的原理 溶液Ⅰ：悬浮 50mmol/L 葡萄糖 25mmlol/L Tris·Cl(PH8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10 lbf/in-2(6.895×10--4pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，贮存于4℃ 溶液I的作用： 50mM葡萄糖：加了葡萄糖后悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 Tris-Cl溶液：控制好溶液的pH EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂 溶液Ⅱ：裂解 0.4mol/L NaOH 2% SDS 临用前配制，1：1混合 破细胞壁的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。 SDS:结合蛋白质 溶液Ⅲ：沉淀 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 溶液Ⅲ加入后，钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而SDS由于与蛋白质结合，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA因为与蛋白质结合也一起被共沉淀了。 2M的醋酸：中和氢氧化钠，因为长时间的碱性条件会打断DNA，基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断就没有办法再被PDS共沉淀了。 由于还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提： 1、酚：萃取蛋白 2、氯仿：调节液体密度 3、异戊醇：消泡剂 。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次。 操作注意事项 第一步：混匀要完全。 第二步：时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；必须温柔混合，不然基因组DNA的断裂会导致抽提的质粒纯度大幅下降。 第三步：冰上操作，严格按操作规程做。 分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，使DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据DNA只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。 DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免剧烈振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛吹，更不能用细的吸头反复吹吸。 3、 取下封边的橡皮膏，将凝胶连同托盘放人电泳槽中，用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。继续倒入缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm。 4、加样 ????? 将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-蔗糖溶液以4：1的体积比混合，分别加入到凝胶板的加样槽内．每个糟加10ul左右。加样量不宜超过20ul，避免样品过多而溢出，污染邻近样品，加样时，吸嘴穿过缓仲液小心插人加样槽底部，不要损坏凝胶，然后缓慢加样。 7、 观察与拍照 ????小心地取出凝胶置托盘上，用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后将胶板放到预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可看到清晰的条带．荧光在4一6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照记录，观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。 有机溶剂抽提法 1、切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。? 2、倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。? 3、加1ml?10%?SDS,?混匀,此时样品变得很粘稠。? 4、加50ul或 1mg?蛋白酶?K,?3