荧光定量PCR技术原理方法数据分析详述.ppt

荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述;不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案;不同样品RNA提取最适方法 RNA纯度与质量考察 RNA提取常见问题及解决方案 常见样品DNA提取 特殊样品DNA提取 DNA分离纯化中常见问题分析;样品;沉淀法：异丙醇或乙醇 介质吸附法：;异硫氰酸胍/苯酚法 在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 ;BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势;组织/细胞样品RNA提取;RNApure 高纯总RNA快速提取试剂;同一样品基因组DNA和RNA分提;特殊样品RNA提取---血液;材料： 松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树 ;图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4Micro RNA (材料为小鼠肝脏组织);生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。 纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。 质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。;RNA提取常见问题及解决方案;RNA的降解;RNA的降解;RNA的保护;蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 ;OD260 /OD280 比值偏低; 非变性电泳： 上样量超过 3μg，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。; 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA ;不同样品基因组DNA提取;基因组DNA提取流程;化学方法 CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。 SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等 物理方法 机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。 酶法 蛋白酶K BioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法;特点： 不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂 多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb;玉米叶片基因组DNA提取 （使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）;特殊样品基因组DNA提取;中量/大量血液基因组DNA提取;土壤/粪便微生物基因组DNA提取;临床样品基因组DNA提取;一步法DNA提取扩增;保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存 ;保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存 ;保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存 ;保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存 ;如何提高微量核酸提取或回收后的浓度;不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ;中心法则与RT、PCR; 逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。 整个过程要求无RNA酶操作。 反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。;Super M-MLV反转录酶 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 Thermo M-MLV反转录酶 高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著 在42℃-60℃具有较好的热稳定性。;One step RT-PCR;RT-PCR相关产品;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ;实时荧光定量PCR技术的应用;Real-time qPCR原理;Real-Time qPCR主要概念;