免疫荧光检测.docx

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ ANA ）的实验方案） 荧光免疫技术 是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为 标准试剂 ，用于相应抗 原或抗体的分析鉴定和定量测定。 荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两 大类。荧光抗体染色技术 是用荧光抗体 对细胞、组织切片或其他标本中的 抗原或抗体 进行 鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流 式细胞仪进行自动分析检测， 称为流式荧光免疫技术。 荧光免疫测定主要有时间分辨荧光 免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体 (ANA)为例 进行实习。 抗核抗体 (antinuclear antibody ，ANA) 又称抗核酸抗原抗体， 是一组将自身真核细胞的各 种成分脱氧核糖核蛋白 (DNP) 、DNA 、可提取的核抗原 (ENA) 和 RNA 等作为靶抗原的自身抗 体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于 胸水、关节滑 膜液和尿液中。 抗核抗体实验原理 以小鼠肝细胞或某些培养细胞 ( 如 Hep-2) 作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如 果血清中含有 ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人 IgG 抗体又可 ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材 1．抗原片 现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： 肝印片制备：取 4-8 周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上 留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1 周。 (2)Hep-2 细胞抗原片制备： Hep-2 细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻 片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 (3) 肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚 4μl 。- 30℃保存备用。 2．异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的抗人 IgG 抗体 (FITC- 抗人 IgG 抗体 ) 有商品供应， 临用时按效价稀释。 3．0.01mol/L pH7.2 PBS 4．缓冲甘油 取甘油 9 份加 PBS 1 份。 5. 待测血清、阳性和阴性对照血清 临床标本筛选获得。 6．器材 荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等 操作方法 1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 2．稀释： PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加 25μl 稀释后血清，至加样板的每一反应 区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育 30 分钟 。 5．冲洗：用烧杯盛 PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有 PBS-Tween缓冲液的小杯中至少 1 分钟。不必混摇。 6．加样：滴加 20μl 荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应 区，完全加完方可继续温育。 荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以 PBS-Tween缓冲液 稀释。 7．冲洗：用烧杯盛 PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有 PBS-Tween缓冲液的小杯中至少 1 分钟。不必混摇。 8．封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油 /PBS 至盖片：每反应区约 10μl 。从 PBS-Tween缓冲液中取出 1 张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上， 立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下 1 张。 结果判定 荧光显微镜下观察 1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为 ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。 2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为： ①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光； ②周边型 ( 核膜型 ) ：细胞核周围呈现荧光；③斑点型 ( 颗粒型 ) ：细胞核内呈现斑点状荧光； ④核仁型：核仁部分呈现荧光。 ⑤混合型：两种以上核染色； ⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型 (ACA) 注意事项 1．PBS-Tween缓冲液在 4℃下可存放两周。 2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的 FITC 标记的抗人球蛋白的量，稀释后可 在 4℃下可存放 1 周。 3．血清或 FITC 标记的抗人 Ig 应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。 4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。 5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要 将载片风干。 6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左