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实时荧光定量PCR原理 樊磊 手机邮箱：lei.fan@ 靶变性 引物结合 RNA 病毒 cDNA 逆转录 延伸 PCR 逆转录 靶扩增 cDNA 普通PCR技术 荧光染料 碳氢化合物 能量捕获效率表达为消逝相关系数 ? 发射效率表达为F 荧光强度与激发光强度(I) 、吸收率(ebc), 、仪器响应(KF)以及其量子产生(F)成正比。  IF = KF I0 F e b c Hex 荧光素 实时荧光定量PCR原理 荧光染料的吸收和发射 实时荧光定量PCR原理 TaqMan水解探针 R Q A C T G A C T G A T A T A C T G G G G G 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR原理 收集每一个循环的荧光读数 阈值：仪器所设定的荧光背景值 Ct 值，定义为 样品荧光强度超过阈值时的循环数，这意味着对数期增长到来 Ct = 33.2 AFL 实时荧光定量PCR原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 定量PCR的数学原理 实时荧光定量PCR原理 定量PCR的数学原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X0= -lg(1+Ex) *Ct+ lg M (3) 最后结论： Lg X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。通常浓度10倍变化，Ct 有3.3个循环变化.高输入浓度，低Ct值 实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 PCR:核酸体外扩增的过程，一个循环包括变性-退火-延伸三个步骤 实时：每一个PCR循环都对荧光信号进行监测 荧光：每合成一个DNA分子即有一个荧光信号产生 定量：模板的初始浓度的对数值与其Ct值成线性关系 lg X0= -lg(1+Ex) *Ct+ lg M 实时荧光定量PCR原理 总结 We Innovate Healthcare * The COBAS? TaqMan? assays utilize the fluorescent dye as labels. It’s important to know the principle of fluorescence. Most fluorescent dyes are heterocyclic or polyaromatic hydrocarbons. Light is absorbed by the dye, which leads to an exited state of the fluorophore that has a lifetime of 10-9 to 10-8 seconds (nanoseconds). While in the excited state the fluorophore can undergo conformational changes or interact with the environment such that energy is dissipated (as photons) or transferred to neighboring molecules (energy transfer – see slide 9). When the fluorophore returns from the first excited state to the ground state, light is emitted at a lower energy (longer wavelength) than was originally captured. * Most dyes absorb and emit in the visible or near infrared regions. Molecular absorption of photons in the ultraviolet-visible (UV-VIS) range by a molecule causes the electronic transition from a l