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PAGE1 / NUMPAGES8 PCR法支原体测定PROTOCOL 关键词 PCR、支原体 修订记录 姓名 部门/职务 签名 日期（年-月-日） 起草人 审核人 批准人 生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部 PAGE2 / NUMPAGES8 1.目的 规范PCR法支原体检测的操作方法。 2.范围 适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。 3.责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。 4.定义 N/A 5.设备、材料和试剂 5.1设备、材料 设备名 生产商 型号/货号 备注 PCR仪 Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A 小型台式冷冻离心机 Thermo HERAEUS Fresco 21 N/A 单道移液器(10ul,20ul,100ul) Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽 Tanon HE-120 N/A 凝胶成像系统 BIORAD ChemiDoc? XRS+ System N/A 5.2试剂 试剂名称 生产商 货号 TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq? TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产 N/A 10×Loading Buffer TaKaRa 9157 DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A 内毒素检查用水 厦门鲎试剂实验厂有限公司 6.溶液配制 6.1 50× TAE Buffer 称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。 6.2 1× TAE Buffer 量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。 7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。 7.1 1st PCR反应 7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系） 试剂 用量（ul） 内毒素检查用水 37.75~38.75 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F1 Primer 0.5 MCGp R1 Primer 0.5 TaKaRa Taq 0.25 7.1.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。 为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul Control Template（阳性对照）及“1ul供试品+1ul control Template”（供试品阳性对照）。 7.1.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。 94℃30sec 94℃ 30sec 55℃ 2min 35 cycles 72℃ 1min 72℃ 5min 7.2 2nd PCR反应 7.2.1按下表顺序配制反应混合液 试剂 用量(ul) 内毒素检查用水 39.25 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F2 Primer 0.5 MCGp R2 Primer 0.5 TaKaRa Taq 0.25 7.2.2用内毒素检查用水将1st PCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同7.1.2。 7.2.3 将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。 94℃30sec 94℃ 30sec 55℃ 2min 30 cycles 72℃ 1min 72℃ 5min 7.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 7.3.1 1%琼脂糖凝胶