蛋白质分离纯化实验论文样板.docVIP

北京理工大学珠海学院 PAGE PAGE 11 胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究 摘 要 胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备，胰蛋白酶的亲和层析分离纯化，凝胶电泳鉴定及分子量测定，胰蛋白酶的动力学研究等。分离纯化蛋白质是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。根据蛋白质的不同性质，分离纯化的方法也是不同的。 关键词：分离定量 亲和层析 凝胶电泳 动力学研究 目 录 摘要 I 1、蛋卵粘蛋白的分离与定量 1 1.1蛋白质沉淀法 1 1.2高速离心法 1 1.3蛋白质脱盐 1 1.4蛋白质定量 2 1.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定 2 2、亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 3 2.1亲和层析法 3 2.1.1亲和层析法的介绍 3 2.1.2亲和层析法的各项要素 3 2.2胰蛋白酶活性测定 3 2.2.1酶活力的测定 3 2.2.2胰蛋白酶活力测定 3 2.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE）法 4 2.2.4酪蛋白法 4 3、胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定………………………………… 5 3.1蛋白电泳槽的组装……………………………………………… 5 3.2凝胶的选择和制备……………………………………………… 5 3.3样品的处理……………………………………………………… 6 3.4电泳……………………………………………………………… 6 3.5染色与脱色……………………………………………………… 6 3.6实验结果及处理………………………………………………… 7 4、胰蛋白酶动力学研究……………………………………… 8 4.1胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数 Km 及最大速率 V 的测定 8 4.1.1绘制时间-光吸收关系曲线法…………………………………8 4.2终止法测定胰蛋白酶的Km、最大速率 V 及胰蛋白酶抑制剂的动力学研究……………………………………………………… 8 5、 总结 11 参考文献 12 谢辞 ………………………………………………………… 13 1 蛋卵粘蛋白的分离与定量 材料：新鲜鸡蛋，透析袋 操作： 1.1蛋白质沉淀法 在各种分离方法中，沉淀法是常用在前面的几个步骤，尤其很多方便的沉淀方法，可以有效地将蛋白质从粗提液中分离出来。 ① 硫酸铵沉淀法：每个蛋白质溶液分子表面上，都分布有若干比例的非极性区域，会凝集许多水分子以便溶入水溶液中；若在此水溶液加入大量硫酸铵，则因为硫酸铵的高度水合能力，抢走聚集在蛋白质表面的水分子，使得蛋白质表面的非极性区域暴露出来，相互以疏水性引力结合，并成为聚合体而沉淀下来。 ② 等电点沉淀法：若把蛋白质溶液的PH调到其等电点，则此蛋白质所带的净电荷为零，分子间的排斥力因而下降，得以相互吸引成聚合体而沉淀。 ③ 溶剂沉淀法：当蛋白质水溶液加入大量有机溶剂，水分子浓度被稀释，蛋白质的溶解度便迅速下降，而沉淀下来。但有机溶剂有丙酮或甲醇，在沉淀后也常用乙醚来带走丙酮，以加速干燥。 另外，三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)是很强的蛋白质变形剂，许多蛋白质遇到TCA都会变性沉淀，无法再恢复原态。TCA对皮肤有很强的腐蚀性，不小心接触后要马上冲水，通常TCA并不被用在纯化蛋白质的步骤中，而是用来沉淀或移除大部分非目的蛋白质。 1.2高速离心法 离心是分离固态与液体最方便的方法，因此蛋白质以上述方法沉淀下来后，接着便可用高速离心法，把形成固态或半固态的带白纸分离出来。这样的离心都要在低温下进行，以免离心时产生高温，导致目的蛋白变性。在实验室中，高速离心机是较危险的仪器，一定要注意离心管是否正确平衡，离心转速是否设定正确。第一次操作任何离心机时，一定要有熟练的人员在旁监督，以免发生危险。 1.3蛋白质脱盐 脱盐是一种重要的生化操作，可以把小分子与巨分子分离开来，是生化实验常用的步骤，通常脱盐效果的好坏，对下一步实验有决定性的影响。有下面几种方法可以使用： ①析袋：是最常用的方法，透析袋有各种大小不同的网目，可以分离分子量不同的大小分子。透析袋一般在使用前需经前处理。 ②体过滤法：可以依照分子量大小不同来进行分离，利用胶体小球内的孔道，使小分子进入而被延滞在胶球内，大分子则得以迅速流出，因而出了盐类，达到脱盐的效果。 ③微薄膜过滤：超微薄膜是一层具有极小孔径的薄膜，可以区别分子的大小，小分子如盐类可以通过微孔，大分子则被保留，因而去除盐类；通常使用超微薄膜过滤都需要加压，以增加小分子通过的速率。 1.4蛋白质定量 蛋白质定量是最基本的生化操作，方法很多，但其原理都还是基于蛋白质分子的基本构造。早先使