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2019-09-09 发布于湖北
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原生质体瞬时表达方法.pdf

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原生质体瞬时表达方法提原生质体酶解缓冲液： 15mL 20mL 0.1M MES （提前70 3mL 4mL ℃ 5min ） 0.8M 甘露醇 7.5mL 10mL 0.2M KCl 1.5mL 2mL ddH2O 3mL 4mL 1.5%Cellulase R10 0.225g 0.3g 0.4% metlase R10 0.06g 0.08g 55℃，10min 冷却至25℃（也可用自来水冷却） 0.25M CaCl2，0.6mL ； 1.5mL 0.1% BSA 用注射器，滤膜过滤除菌至培养皿，遮光用剪刀从叶柄处剪下叶片，去除上下部分，只保留中间部分，用刀片切成细条越细越好，把细条放入酶解液真空抽气30min （遮光）黑暗静置4h 配制PEG （现用现配，最多过一天）避光常温摇床缓慢摇 20-30min 至无可见叶组织用镊子夹起两三个细条放在滤纸上搓两下，如果成沫则酶解充分，如果不成沫则继续酶解。加15mL W5 用手缓慢摇匀 200 目小筛子过滤至80mL 离心管中 4 ℃ 150g 离心2min 尽量去除上清，留一点上清混匀细胞计数（一般不做）， 4/样品 1-2X10 用1mL W5 重悬，换至2mL EP 管中冰上静置15min，去上清常温常温1mL MMG1mL MMG 重悬（可分别将重悬（可分别将MMGMMG 稀释稀释55 倍、倍、1010 倍、倍、2020 倍、倍、 100100 倍等，不过一般取原液、倍等，不过一般取原液、55 倍工作液两种即可）倍工作液两种即可）取少量于凹的载玻片上，显微镜观察原生质体活力加15-20 μg 质粒到2mL EP 管中加200 μL 原生质体到上面的2mL E