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工业生产用酶 核酸类化合物5’-IMP和5’-GMP是制作鲜味调味品的原料，工业规模化生产这些核苷酸的方法之一就是用酶法对发酵产生的核苷进行磷酸化。 许多微生物可以利用无机磷酸对核苷进行磷酸化，化学反应如下： 具有调味作用的只有5’-核苷酸，所以先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特异性地对核苷的5’OH进行磷酸化的菌株，成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。 核苷 + PPi → 5’-核苷酸+ Pi 工业生产用酶 然后选择5’-核苷酸产量最高的菌株Morganella morgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了酶学研究，发现其有两种活性： 核苷磷酸化酶活性： 磷酸酶活性： 要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸化酶活性，同时抑制其磷酸酶活性。 改造步骤： PCR法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选5’-核苷酸合成能力高的菌株 次黄苷 + PPi → 5’-IMP + Pi 5’-IMP + H2O →次黄苷 + Pi 工业生产用酶 在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高的菌株，其中的酶发生了Gly92Asp和Ile171Thr的突变； 突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显加强，5’-IMP的生产性能大幅提高，而且IMP的水解也受到抑制。 生成的核苷酸只有5’-核苷酸，没有2’-、3’-核苷酸副产物。 此外，该酶的底物特异性广泛，适用于各种5’-核苷酸的生产。 工业生产用酶 进一步，研究人员对Escherichia blattae 来源的这种酶进行了结晶和结构解析。 根据结构信息，对一些位点进行了定点突变，如Ser90Phe的突变，使酶对次黄苷的Km下降60%，大幅提高了酶的反应能力。 经过一系列的研究之后，最终确立了新型的酶法核酸鲜味调味品的工业生产技术，并于2003年开始投入生产（味之素株式会社）。 1D2T 味之素 日本味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企业之一，是世界上最大的氨基酸供应商之一。产品涉及食品、药品等多个领域。 味之素不但生产赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生产量在世界上都是最大的。在氨基酸领域处于领导者地位的味之素集团，运用最先进的独创技术，广泛地开发了氨基酸的用途。 味之素已在中国建立18家公司，业务涉及调味品、加工食品、医药/工业用/饲料氨基酸等。当前味之素在中国的核心业务围绕调味品及加工食品展开。 蛋白质的产率问题 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。 与载体有关的因素主要有： 表达载体拷贝数的调控 启动子的强弱与转录调控 转录终止子的效应 密码子的使用频率 信号肽的特征与分泌调控 影响产率的宿主因素主要有二：①mRNA的稳定性；②宿主的蛋白质降解系统。 载体拷贝数 通过调控基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作‘基因的剂量效应’，是一个对生产过程产生较大影响的因素。 在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与ori有关。在克隆实验中常使用拷贝数~100的多拷贝质粒。 在以E. coli为宿主的生产中，常使用可以根据培养温度调整拷贝数的runaway质粒（如pCP3），42 ℃时拷贝数最高可达几千个。 lacZ’ ampr 复制起点ori 启动子的强度 启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合RNA聚合酶并引发转录过程。 原核基因的启动子主要包括-35和-10区，真核基因启动子则主要是TATA盒与一些上游转录活化序列UAS。这些序列被称作顺式作用元件（cis序列）。 一般认为启动子的强度与cis序列的最佳配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试把不同基因的启动子的cis序列进行重组。 -35 -10 RNA 聚合酶 原核基因启动子 UAS TATA RNA聚合酶 真核基因启动子 启动子 根据表达的方式可以把启动子分为两类： 构成性表达启动子：持续表达 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。 宿主 启动子 构成性表达 诱导表达 大肠杆菌E. coli lac, tac, ara pBAD, λPL, T7 枯草芽孢杆菌 蛋白酶、淀粉酶基因的启动子 酿酒酵母S. cerevisiae ADH1，TDH3 GAL1，PHO5 毕赤酵母P. pastoris GAP AOX 诱导性表达 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。 E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。 E. coli 的乳糖操纵