自杀质粒法构建基因缺失株.pptVIP

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2019-09-10 发布于北京
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自杀质粒法构建基因缺失株.ppt

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自杀质粒法构建基因缺失株指导教师：李槿年教授学生：王薇目录一、自杀质粒方法原理简介一、自杀质粒方法原理简介 1.同源臂扩增 2.DNA片段和载体的酶切与连接三、接合转移单交换双交换野生型四、双交换的筛选及鉴定 * LOGO LOGO 自杀质粒方法原理简介 1 重组质粒的构建 2 接合转移 3 双交换的筛选及鉴定 4 自杀质粒：通常为R质粒的衍生质粒，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。上下游同源臂 sacB cat 接合 DNA片段和载体的酶切与连接重组质粒同源臂扩增二、重组质粒的构建 NCBI上BLAST要敲除的基因出现很多菌株的同源序列截取待敲除基因两侧的基因片段各500bp左右分别进行序列比对以序列比对后同源性较高的一段序列为模板，进行引物设计 PstⅠ SacⅠ 外源DNA插入酶切载体重组外源DNA片段（上下游同源臂） PstⅠ SacⅠ 通过化转，导入宿主细胞 E.Coli S17-1 抗性筛选 Sm、Cm E.Coli S17-1 HX4 种子液转摇对数期 1:1混合 4℃，3000g/min离心3~5min 沉淀用LB洗涤两次，再用100μL 重悬弃上清 Km、Cm 30℃，5~8h 用1mL LB洗菌，涂布双抗平板 30℃ 接合后，自杀质粒被导入HX4中，由于不能自主复制，所以质粒靠同源臂与HX4基因组发生以下三种方式的同源重组野生型双交换单交换四、双交换的筛选及鉴定 SacB Cat F1 F2 F1 F2 SacB Cat SacBS 、CmR F2 Cm F1 SacB Cat F1 A F2 SacB Cat F1 Cm F2 F1 A F2 F1 Cm F2 SacBR 、CmR SacB Cat F1 Cm F2 F1 A F2 F2 Cm F1 F1 A F2 SacB Cat F1 A F2 SacBR 、CmS 挑取在双抗平板上长出的接合子单菌落接种于不含抗生素的平板上四区划线于含Cm的25%蔗糖培养基中，26~28℃培养 PCR鉴定，用各自引物分别扩增Cm及OmpU基因 * LOGO