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吸光光度法 吸光光度法基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测定条件的选择 吸光光度法的应用 紫外吸收光谱法简介 精选 吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称之为吸光光度法。 包括 比色法 可见分光光度法 紫外分光光度法 红外光谱法 精选 吸光光度法 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400?750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200?400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5?1000 ?m ,主要用于有机化合物结构鉴定。 精选 吸光光度法 特点 灵敏度高 适用于微量组分的测定 相对误差约为 2 %一 5 % 测定迅速 仪器操作简单 价格便宜 应用广泛 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 光的波段划分 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 当一束白光（由各种波长的光按一定比例组成）通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。透射光（或反射光） 刺激人眼而使人感觉到颜色的存在。因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。 能够组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质颜色与吸收光颇色的互补关系 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量被分子、原子所吸收，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态） M + 热 M + 荧光或磷光 M + h ? ? M * 基态 激发态 E1 （△E） E2 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级， 仅当照射光的光子能量与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。 不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。 所以物质对光的吸收具有选择性 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 吸收曲线（吸收光谱）----物质对不同波长光的吸收能力 的描述 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图 最大吸收波长----同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变 在吸收峰及附近处的吸光度随浓度增加而增大 而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 精选 吸光光度法 / 吸光光度法基本原理 定性分析----不同物质其吸收曲线的形状和最大吸收波长各不相同。根据这个特性可用作物质的初步定性分析 定量分析---- 不同浓度的同一物质，在吸收峰及附近处的吸光度随浓度增加而增大。根据这个特性可对物质定量分析。若在最大波长处侧定吸光度，则灵敏度最高。 吸收曲线是吸光光度法定量分析时选择测定波长的重要依据。 精选 吸光光度法 / 朗伯一比尔定律 朗伯阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b （朗伯动画1） （比耳动画2） 比耳提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝ c 二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为： 精选 吸光光度法 / 朗伯一比尔定律 A＝lg（I0/It)= k b c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１； 或: A＝lg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位g·L－１ a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１ a与k的关系为： a =k / M （M为摩尔质量） 精选 透光度T : 描述入射光透过溶液的程度: T = I t / I0 吸光度A与透光度T的关系: A ＝ －lg T 摩尔吸光系数k在数值