第十三章节分子诊断资料.pptVIP

* * 第十二章 分 子 诊 断 一、分子诊断的概念和特点 概念： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人体健康状态和疾病作出诊断的方法。 传统的诊断：表现型→基因型 基 因 诊 断：基因型→表现型 （ 逆向诊断） 特点 特异性强 灵敏度高 早期诊断性 适应性强 一、分子诊断的概念和特点 检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平 已明确疾病表型与基因型的关系 分子诊断的前提 * 二、分子诊断策略 直接诊断——直接检测致病基因的突变 基因突变类型—缺失、点突变、重复、插入等 间接诊断——应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 DNA多态——RFLP、VNTR、SNP DNA多态（DNA Polymorphism） 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类： 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性（VNTR）：如STR其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR ，为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：发生在基因组中的单个核苷酸的替代，为第三代多态性标记。 二、分子诊断策略 三、分子诊断常用技术 核酸分子杂交技术 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO) DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 PCR-SSCP DNA测序 DNA芯片技术 点突变（C to T） 5’ 3’ 3’ 5’ G 5’ 3’ 引物1 引物2 探针1 探针2 A 等位基因特异寡核苷酸探针（ASO） 原理 指DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一限制性识别位点，使DNA限制性片段长度发生变化，在人群中形成两种或两种以上的限制性类型 利用特定限制性识别位点进行基因分析 限制性片段长度多态性分析（RFLP） RLFP分析法 RFLP分析 优点 分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观 主要用于核酸变异分析比较, 微生物的分群分型，癌基因分析，遗传病的诊断等。 局限 只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测效率低。 原理 将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 优点 检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需特殊设备，适用于大样本筛选。 己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。 PCR/单链构象多态性分析（SSCP） （ PCR-SSCP）示意图 DNA测序 DNA自动测序结果举例 DNA芯片技术 四、分子诊断的应用及举例 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 × MstⅡ酶切位点(CCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 GAG → GTG ↓ 谷Aa→缬Aa + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 Normal βΑGene Probe——与正常 Probe βΑ杂交稳定 Mutation βS Gene Probe——与异常 βS杂交 稳定 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 * 斑点杂交结果： 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 异常探针 正常人 纯合突变 杂合突变 Leber 病患者 PCR/SSCP分析 + ﹣ *