碱裂解法原理染色体dna比质粒dna分子大得多.pptVIP

核酸的提取及鉴定;一、核酸的分类;二、DNA提取的几种方法;质粒DNA－碱裂解法;质粒DNA－碱裂解法;质粒DNA－煮沸法;细胞器DNA－差速离心法;（二）基因组DNA的提取－ CTAB法;　CTAB提取缓冲液的经典配方;　CTAB提取缓冲液的改进配方;　CTAB法流程图; SDS法原理; SDS法流程图 （以动物组织为例） ;（三）基因组DNA－其它方法;（三）基因组DNA－其它方法;（三）基因组DNA－其它方法;（四）动物基因组DNA的提取; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中提取DNA。 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。 ;（3）苯酚抽提法:;1. 材料、设备及试剂;1）在500μl抗凝血中加入ligsis buffer 1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2）沉淀中加入ligsis buffer 1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min 。 3）彻底弃去上清，加入extraction buffer 500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h 。 4）加入8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。; 6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 ;核酸的理化性质;分离纯化核酸总的原则：;核酸制备时应注意的事项: ; 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。;①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。;①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 ; 常用的RNA酶抑制剂 ;核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1、溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。; 作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用 ;DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质 溶菌酶：破碎细胞 ;四、 核酸制备的一般步骤： ;1、材料准备; 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂;首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离 使核酸与蛋白质分离 除去脂类 多糖的除去; 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 ; 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：