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3. 用原位杂交进行RNA区域定位 原位杂交（ISH）是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。 （二）用PCR技术检测RNA表达水平 1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析 逆转录PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。 2. 用实时定量PCR进行RNA的定量分析 实时定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。 （三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平 1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。 2. 用循环芯片测序技术分析基因表达谱 运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。 二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达 （一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽 （二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽 酶联免疫吸附实验（ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体， 目录 目录 基因结构和功能分析 第二十二章 基因结构与功能分析技术 The Analysis Technology for Gene Structure and Function 人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构与功能。 DNA序列测定 基因转录起点及其启动子的分析 基因编码序列的分析 基因拷贝数及其表达产物的分析 基因功能获得和/或缺失策略 随机突变筛选策略 第一节 基因结构分析技术 一、基因一级结构解析技术 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序（DNA sequencing）。 （一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法 Sanger双脱氧测序（dideoxy sequencing）法 Maxam-Gilbert化学降解测序法 （二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于Sanger双脱氧法 1. 四色荧光法： 采用四种不同的荧光染料标记同一引物或4种不同的终止底物ddNTP，最终结果均相当于赋予DNA片段4种不同的颜色。因此，一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳。 2. 单色荧光法： 采用单一荧光染料标记引物5′-端或dNTP，所有产物的5′-末端均带上了同一种荧光标记，一个样品的四个反应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳 （三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术 焦磷酸测序技术操作简单，结果准确可靠，可应用于单核苷酸多态性位点（SNP）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于Sanger法。 （四）循环芯片测序被称为第二代测序技术 循环芯片测序（cyclic-array sequencing） ① 可实现大规模并行化分析 ② 不需电泳，设备易于微型化 ③ 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势： 技术平台：454测序、Solexa测序（Illumina测序）、SOLiD测序等。 基本流程： ① 将基因组DNA随机切割成为小片段DNA； ② 在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库； ③ 将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面； ④ 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 ⑤ 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。 （五）单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策略： ① 通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）； ② 利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序； ③ 直接读取单分子DNA序列信息。 二、基因转录起点分析技术 转录起点（transcription start site，TSS） （一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS 以mRNA为模板，经逆转录合成cD