管碟法测定抗生素效价课件.ppt

管碟法测定抗生素效价;目录;;1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点。 2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性的关系。 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。 4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。;在中国药典2010年版二部附录Ⅺ抗生素微生物检定法及2015版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素效价的方法，根据公司生产及检测情况，主要是硫酸??大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用抗生素管碟法测效价来计算含量，因此，此章主要介绍管碟法。 ;抗菌活性;2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，测定供试品的效价。 ;两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。 当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。 ;量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV生物检定统计法）;根据中国药典2010年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒测效价，选取短小芽孢杆菌作为试验菌。 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。;流程图;1.复活 从菌种保藏机构购回的标准菌株，是冷冻干燥粉，需经过复活。（冻干菌种为第0代）;无菌操作，将冷冻干燥菌种安瓿用75%乙醇消毒后，用砂轮在安瓿颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安瓿顶部，立即作灭菌湿纱布盖住顶部，安瓿顶部便骤然裂开，小心移去玻璃碎片，用一无菌毛细管吸取0.5-1ml适宜的液体培养基，直插安瓿底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解，再将安瓿内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度培养18-24小时。（此为第一代）;制保藏用菌株; 试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置5℃冰箱中保存。;革兰染色法;涂片;染色;图片染色步骤;革兰染色原理;革兰染色注意事项;革兰染色结果;革兰染色结果;管碟法的操作步骤 预试验 试验准备 双碟的制备 供试品、 标准品溶液的制备 菌层的制备 放置小钢管 滴加抗生素溶 液 双碟的培养 抑菌圈的测量 结果的可 靠性检验及效价测定;预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm.? 高低剂量之比为2:1.;试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。;试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.? ;抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲