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液体活检专业医学知识宣讲 Outlines 分子医学时代的入口 ctDNA的研究进展和临床应用 CTC的研究进展和临床应用 分子医学时代的入口 分子医学时代的来临 2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤异常谱型，是“人类基因组计划”后又一重大科学研究。 2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包括致癌突变、甲基化和基因copy数变化等数据。 对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史转变！ 精准医疗：Precision Medicine Initiative ?在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time 液体活检，分子医学的入口 —— “三驾马车”：CTC、ctDNA 和外泌体 分子医学时代的入口 液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期， Exosomes 活细胞分泌，40-100nm，1个活细胞状况实时监控指标 母细胞来源标志物（RNA／蛋白质），可用于早期诊断 稳定，含量较高，内容物多样性，受干扰因素少 检测相对简单 ctDNA 死细胞释放，杀伤性治疗效果的实时监控指标 ctDNA是一组Panel，癌变标志物，没有组织特异性和无癌症分期的区分 不稳定，含量较低，受干扰因素多 CTC 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步 复发监控 用药指导 超早预警 早癌发现 鉴别诊断 疗效监控 预后评估 转移分析 药物选择 CTC、ctDNA 和外泌体的差异 分子医学时代的入口 CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用 血清蛋白标志物 血清/尿液外泌体蛋白标志物 （中晚期诊断及疗效判断） 血浆甲基化标志物 血清外泌体miRNA标志物 尿液外泌体RNA标志物 （早癌诊断、鉴别及疗效判断） ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估） 组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物 CTC预后评估 分子医学时代的入口 ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的来源 ctDNA的研究进展和临床应用 标志组合（panel） 每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。 不断演变及变化 每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%； 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性 ctDNA的特征 ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的临床应用 无创、全面、实时、便捷 ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA指导用药 CAPP-Seq NGS用于血浆ALKROS1融合检测 8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1融合 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小 -- AM. Newman,et al.Nat Med 2014 ctDNA预后评估 1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。 -- Breast Cancer Res Treat,2015,March 2. ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。 ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA动态监测 ctDNA的研究进展和临床应用 分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的ctDNA和活体组织切片 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配 -- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86 ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的研究进展和临床应用 中通量 数十个点检测 灵敏度高 低通量 数个点检测 灵敏度最高 高通量 上万个点检测 应用前景广阔 荧光定量PCR 数字PCR NGS测序 ctDNA检测平台 ctDNA临床应用瓶颈 NGS在ctDNA上应用的难点 假阳性问题：需要纠错技术 NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的“假突变”。 2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。 漏检