基因克隆载体课件.ppt

TA克隆 TA载体的再生方法 （1）克隆载体线性化 （2）克隆载体末端补平反应 （3）克隆载体末端加T反应 注：再生后的TA载体，原线性化的酶切位点消失 5’-GGCTGGCTGG NNNCAGGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3’ LB 5’-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3’ RB 图 T-DNA的LTS核苷酸序列（LB）和RTS核苷酸序列（RB） MCS连杆 第二节 病毒（噬菌体）克隆载体 病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体 分类（根据病毒与宿主的关系） 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后 一、λ噬菌体克隆载体 （一） λ噬菌体性质 λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点) 2、λ噬菌体基因组有基因50个以上 J与N、P与Q之间为非必需序列 3、 限制性核酸内切酶位点: 56种（p477） 4、 λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径→宿主合成int基因产物→λ-DNA整合到染色体DNA上 →某种胁迫条件下→合成six基因产物→λ-DNA脱离细菌染色体→溶菌 （二）构建依据 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点 （三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统 技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES – λβ为例，EcoRI （48.5kb） λDNA E co R I 6个片段 B片段是λ噬菌体生长非必需的； C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 两端EcoR I别点经点突变或甲基化处理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb） 克隆能力： 替换B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5） 4.9kb 21.6kb 5.5kb 7.5kb 5.9kb 3.3kb 2、在λDNA的非必需区内插入选择标记基因 （1）自然筛选（51kb或36.4kb不能包装） （2）插入选择标记基因 ①取代red和gam基因 野生型λ噬菌体(Spi+表型) 在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长 （red、gam基因） 外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 ②最常用的筛选标记：Lac Z基因 3、建立重组λDNA分子体外包装系统 体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。 野生型λ噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。( 见教材解释：新版p115) D-（D基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除D蛋白以外所有蛋白质 E-（E基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除E蛋白以外所有蛋白质 混合 D、E互补 包装λDNA分子 → λ噬菌体 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-) （四） λ噬菌体克隆载体的应用 1、建立c DNA基因文库 转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。效率高。 转染(transfection) 指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。 2、克隆外源目的基因 （五）重组λDNA分子的体外包装（自学） 1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的检验 2、制备包装物 3、体外包装 （一）构建策略 由质粒和含cos位点的λDNA片段组装成的载体，即cosmid克隆载体,又叫粘粒; 或：cosmid克隆载体是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。 二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体） （二） cosmid的特征 (教材新版p118) 1、环形双链DNA分子,　≤36.4kb,　一般＜10kb 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3、