细胞培养和材料细胞毒性检测课件.ppt

细胞培养和材料细胞毒性检测; 前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测 ; Wilhelm Roux (1850-1924 );Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873d. 1944 ;器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。 细胞培养(cell culture)：把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养，增殖。 ;细胞培养的优点;培养细胞与体内细胞的差异;体外培养细胞的生长类型;来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核; 生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动 ;培养细胞的生长和增殖过程;细胞培养的工作原则;3.细胞培养的基本条件;常用仪器与设备;细胞培养器材;√;基础培养基 80％～95％ 血清 5％～20％ 青、链霉素 各100U／ml ;天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） ;常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌; ;抗生素溶液;主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。 常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌。 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 ;物 品; 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。;得到细胞;接种数量为5×104～8×105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。;游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性 ;细胞观察;细胞计数;细胞生长的指标;细胞活力测定;四唑盐（MTT）比色法 MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。;细胞培养的其他指标;细胞固定与染色;细胞污染;细菌污染;真菌污染;支原体污染;污染的控制;6.细胞冻存与复苏;慢冻快融;7.细胞的管理及保藏;细胞库的建立;细胞保存机构;;样品准备 →辐照灭菌 将待检材料在相应条件下浸提（不含血清的培养基中在37℃环境下浸提24h） 细胞计数 接种于96孔培养板，置CO2培养箱37℃培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，供试品加入样品浸提液（加血清），置CO2培养箱继续培养（至少24h） 于设定培养时间后置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20μL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4