促红细胞生成素对脑出血大鼠的神经保护作用和机制探讨.docVIP

PAGE PAGE 1 促红细胞生成素对脑出血大鼠的神经保护作用和机制探讨 　　[摘要]目的研究大鼠脑出血不同时期脑水肿、Fas相关死亡域蛋白（FADD）表达和细胞凋亡及红细胞生成素（EPO）对其的影响，探讨EPO对脑出血的神经保护作用和机制。方法SD雄性大鼠随机分为假手术组、出血组、EPO治疗组，采用自体血脑内注射法建立脑出血动物模型，应用免疫组化方法检测脑出血后不同时间点血肿周边脑组中FADD表达情况，TUNEL法检测凋亡细胞，用干湿比重法测定脑组织含水量。结果与模型组比较，EPO治疗组脑组织含水量明显降低，FADD表达减少，凋亡细胞减少。结论EPO可以减轻脑出血后的脑水肿；EPO通过抑制FADD表达，抑制脑出血后血肿周围神经细胞凋亡，减轻继发性损伤，起到神经保护作用。 　　[关键词]促红细胞生成素；脑出血；脑水肿；FADD；细胞凋亡 　　[中图分类号]R493；R743[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2013）03-0001-03 　　脑出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）后血肿本身及继发性水肿压迫直接损害脑组织外，血肿周围脑细胞继发性凋亡机制也参与ICH后脑损伤。相关实验证明促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）及相应受体（EPOR）在神经组织中均有表达[1-2]。动物实验及临床研究均发现EPO具有神经营养和神经保护作用。Fas相关死亡域蛋白（Fas-associatedwithdeathdomainprotein，FADD）是死亡受体介导凋亡途径重要的启动子，在细胞凋亡中起到重要的作用[3]。本实验通过观察促红细胞生成素对脑血肿周围细胞FADD表达与细胞凋亡的影响，以及血肿周围脑组织水肿影响，探讨促红细胞生成素的神经保护作用及相关机制。 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　健康雄性SD大鼠126只，体重（250±30）g；河北联合大学实验动物中心提供，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。兔抗鼠FADD多克隆抗体、二抗试剂盒及TUNEL试剂盒、DAB显色试剂盒、采购于博士德生物工程有限公司；重组人促红细胞生成素（EPO）购自上海克隆生物高技术有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1脑出血模型制备雄性SD大鼠126只，随机分为脑出血组、脑出血EPO治疗组、假手术组。每组再根据时间先后分为术后3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d共七组，每组6只大鼠。EPO治疗组于术后立即腹腔注射EPO3000U/kg，此后每24小时腹腔注射同等剂量EPO，其余组在相应时间点注射等量的生理盐水。模型制备：术前48h大鼠头部预先脱毛，术前12h禁水及饲料，10%水合氯醛（0.035mL/kg）腹腔麻醉大鼠。根据汤继宏[4]等报道方法结合大鼠立体定位图谱，在立体定位仪上，从头部正中纵向切开皮肤，双氧水剥蚀骨膜，于前囟前0.2mm中线向右旁3mm处钻孔，同时用温水浸泡鼠尾，消毒后断尾取血，微量注射器抽血50μL孔中垂直进针6mm，均速旋转针芯推注，整个过程时间控制在3min内完成。推注血液后保留不动10min后退针；骨蜡封闭骨孔，缝皮。术后大鼠可自由活动、进食。假手术组有微量注射器进针过程，不注射血液。 　　1.2.2脑组织标本制作根据实验设计的时间点用水合氯醛（0.04mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，开胸暴露心脏及主动脉，用磨钝12号针头从左心室插入直至主动脉，刀片划破右心房。用注射器将37℃生理盐水慢速注入体循环，约200mL后右心房流出的液体无色，换用4%多聚甲醛磷酸缓冲液250mL灌流5min直至大鼠尾巴及四肢僵硬。开颅取出血侧针孔前出血灶周围约100mg进行脑组织含水量测定，余大脑置于4%多聚甲醛后固定24h以上，取标本针孔后约2mm脑组织，制成切片备用。 　　1.2.3FADD免疫组织化学染色方法①脑组织切片逐步梯度脱蜡至水。②置3%H2O2液体20min。③高温修复抗原。④封闭液30min，PBS洗涤，兔抗鼠FADD多克隆抗体37℃湿盒反应1h，PBS洗涤。⑤滴加二抗，37℃湿盒孵育1h，PBS洗涤。⑥过氧化物酶溶液37℃反应30min，滴加DAB剂覆盖组织，室温避光显色3～5min至显色，水洗终止反应。⑦苏木素复染，水洗终止反应，充分蓝化30min。树胶封片。 　　1.2.4细胞凋亡检测步骤①标本切片脱蜡至水；②置配制的3%H2O2溶液于室温20min；③标本片加0.01MTBS1：200新鲜稀释ProteinaseK37℃消化1～15min；④TdT和DIG-d-UTP各1μL，加入18μL标记缓冲液中，滴在样品上置于湿盒中，37℃标记2h。⑤加封闭液50μL/片，室温30min；⑥抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体；⑦抗体稀释液1∶