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限制性核酸内切酶EcoRⅠ对质粒DNA的切割 EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8切割 潘晓婷 0820010046 广州大学生命科学学院学院08级 摘 要 本实验采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果为图1中第10栏的条带，质粒DNA酶切后产生6个片段，大小分别为289bp；450bp；612bp；873bp；1363bp；2613bp。 关键词 限制性核酸内切酶 EcoRⅠ 质粒DNA 切割 琼脂糖凝胶电泳 前言 限制性核酸内切酶存在于细菌细胞中，起防御噬菌体感染的作用。由于它们对DNA 的剪切作用，因此内切酶可作为分子生物学研究者的“剪刀”广泛应用于基因操作中。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type Ⅰ）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 研究人员通过使用15种限制性内切酶酶切重组质粒pBKrsv-MLCK，探讨了限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法（熊江霞,朱华庆,王雪等，2003）[1]。近几年，各种动物体内线粒体DNA的酶切分析的研究十分广泛，并取得了一定的成果（叶绍辉,彭和禄,王文等，1998 [2]；关海红,石连玉,刘明华等，2000 [5]；戴建华,殷文莉，2004 [4]；袁思霓,张碧乾等，2008 [3]）。采用Tru 9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/PstⅠ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究同样有所帮助（王荻,徐革锋,刘洋等，2009）[6]。 本实验采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行限制性酶切研究其应用。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料 重组质粒pUC19-P35S:ARF8 限制性内切酶：EcoRⅠ、 琼脂糖 1.1.2 实验设备 水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，微波炉，凝胶成像系统等。 1.1.3 实验试剂 5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液，贮存于4℃ 溴化乙锭EB溶液母液：将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器储于室温即可 DNA分子量标准：从小到大为100bp,250bp，500bp,750bp，1000 bp,2000bp 1.2 方法 1.2.1 DNA酶切反应 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可影微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 混匀反应体系后，将eppendorf管置于PCR仪，设置温度37℃，保温2小时，使酶切反应完全。 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应。 1.2.2 琼脂糖凝胶的制备 1. 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。 2. 胶液的制备： 称取0.4琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部溶化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液，加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。 3. 胶板的制备： 将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应于胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至0-60℃的琼脂糖液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5μg /ml。 用移液枪吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固部均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后想槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽总，所以要注意包装样品槽中应注满缓冲液。 1.2.3 电泳分离DNA片段 1.加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载