《基因芯片技术》第2章-基因芯片的制作.pptVIP

基因芯片技术;内容提要： 一、 基因芯片制作方法概述 二、 芯片基片的制作 三、 探针的制备 四、点样仪与点样过程 五、原位合成法;基因芯片的示意图;4;98-10-23;DNA Chip Technology;7;Reference;9;Lab on a chip;11;探针：固定在支持介质表面的DNA，称为探针 靶基因：样本中经标记的DNA，称为靶基因 基因芯片的制作：原位合成法 直接点样法（合成后点样） ;原位合成与直接点样法比较 ;点样针 （2003年统计结果） ;第二节　芯片基片的制作 基片：探针的支持物品;选择支持物（基片）时，要考虑的因素： 1. 液体在其表面的扩散性 2 .支持物固有的荧光背景 3 .表面添加的化学基团 4 .化学稳定性和构建的复杂性 5 .化学修饰和衍生的适应性 6 .固定在支持物上的点的表面积 7 .最终产品的核酸承载能力和非特异性结合状况 ;一、常见的基片类型 ;1.膜型;;3 三维基质包被玻片 例如，将正电荷尼龙膜附着在玻片上 例如，Perkin Elmer公司在玻片表面包被一种专利集合物。 优点：与DNA结合能力更强，反应更灵敏 用途：多用在蛋白质芯片中;微板型基因芯片;5 集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体，有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）。 ;二、探针分子与基片表面的作用方式 化学偶联：形成共价键 物理吸附：通过次级键（如离子键） 两者共同作用 探针：带负电荷 所以，基片表面要连接带正电荷的基团 固定率=共价结合的探针分子数量/共价结合和静电结合的探针分子总量;1 氨基修饰玻片;2 同型双功能偶联剂包被的基片 同型双功能偶联剂：含有两个相同的活性基团的化合物， 两个活性基团，一个连接氨基修饰玻片上的氨基，一个连接探针中的氨基 前提：玻片要进行氨基修饰，探针也要进行氨基修饰 同型双功能偶联剂： DSC、DSO、DMS等等;3 连接硫醇基修饰寡核苷酸的玻片 前提：探针连接硫醇基修饰，即形成SH-oligo 玻片氨基硅烷化表面修饰;4 环氧硅烷化 前提：核苷酸氨基修饰 特点：耐热、不耐湿;5 聚酰氨胺树形连接分子 聚酰氨胺（PAMAM），树形，固定率高;第三节探针的制备 探针主要分三种： cDNA探针（互补DNA序列）——基因表达谱研究 寡核苷酸探针（oligo nucleotide）——基因表达谱研究 基因组DNA探针（genotic DNA）等——比较基因组杂交 ;1 cDNA探针制备;2 寡核苷酸探针;3 基因组DNA探针;第四节　点样仪及点样过程 　 一、接触式点样法;34;2 鹅毛笔针和裂隙针 毛细原理：在细缝中形成一段样品的液柱，然后在三维工作平台作用下转移到相应的位点，向下轻触玻片，将一定体积液体转移，形成样点。 特点：细缝容易堵;3 毛细管笔 不用每次取样，但是也爱堵;4 针与环结构 环取样，针点样 没有死腔，不会造成样品残留，无污染 不堵 样点均一 缺点：用样品多，样品浓度随时间增加而变浓 ;2202芯片点样仪? 生产商 Bio-Rad? 性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴) ， 重复性：3um 球面精确性：l0um 一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量82,000个点 ;39;40;合成后点样板;二、非接触式点样法　压电打印原位聚合技术;把探针固定在玻璃表面 封闭玻片未点样的区域：防止杂交时与样品DNA非特异性结合。;第五节 原位合成法一、原位光刻合成; ;Peter J. Russell, iGenetics: Copyright ? Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.;Affymetrix芯片介绍;当合成过程全部完成之后，石英片去除保护基团，切割成小块，每一块即为一张芯片。 每张芯片被装在一个塑料舱中，便于贮存和操作，同时也提供了在扫描仪中精确、重复定位芯片的装置。样品室深1mm，可以容纳200μL杂交液体。 ;Affymetrix 原位合成;探针问题;NimbleGen Maskless Array Synthesis （MAS）;数字微镜晶片反射一定图案的紫外光到基片上，形成光暗相间的部分，亮的位点光敏基团去保护，发生核苷酸偶联，暗的位点光敏基团保持不变;本章小结:;思考题：;拓展题： 1 目前基因芯片基片有哪些新发展？ 2 你对点样针的发展有哪些想法？ 3 你对无接触式点样法的发展有哪些想法？ ;The End Thank you