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分子机制研究套路（二） 蛋白翻译后修饰-泛素化 课题：蛋白A调节蛋白B泛素化和降解的研究 1．概念介绍： 大多数蛋白均需进行翻译后修饰来扩增蛋白质组的数量，调节蛋白质的稳定性、分布和功能。翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、亚硝基化、氧化等等。 泛素化是在蛋白质翻译后,通过将泛素分子结合到靶蛋白上,形成多聚泛素链,带有多聚泛素链的靶蛋白可被26 S蛋白酶体识别、降解。泛素是76个氨基酸的多肽片段，包含7个赖氨酸残基，允许同时发生聚泛素化反应。在赖氨酸-48聚泛素化会导致其通过28S蛋白酶体降解。然而赖氨酸-63可以改变细胞的功能，包括运输和DNA修复。可见，单一的泛素化会依据其作用位点的不同而产生不同的结果。 它和泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和蛋白酶体组成了泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）。UPS是细胞内非溶酶体途径蛋白质降解通路，不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质，而且能降解转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白，对于维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡和控制细胞周期等过程有重要的作用。UPS还可作用于转录因子及体内的某些信号传导通路，并参与细胞凋亡、主要组织相容性复合体抗原递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等多个细胞生理活动，对维持细胞正常生理功能具有重要意义。 2．示意图： 图1 UPS的发生依赖于三种酶的参与。E1通过硫酯键将E1酶半胱氨酸与泛素分子连接在一起，其能量来源于ATP水解作用；E2与泛素蛋白连接于激活的半胱氨酸位点；E3 负责将泛素化蛋白与靶蛋白结合在一起， 3．研究思路： TOC \o 1-3 \h \z \u 3.1 蛋白A降低蛋白B的表达量 3 3.1.1 蛋白A介导蛋白B降解 3 3.1.2 蛋白A降解蛋白B的特异性 3 3.1.3 蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性 3 3.1.4 蛋白A调节蛋白B稳定性 4 3.2 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统 4 3.2.2 蛋白B降解位于蛋白酶体系统 4 3.2.3 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统 5 3.3赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点 5 3.3.1 蛋白A介导蛋白B泛素化 5 3.3.2赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点 5 3.4 蛋白A氨基端与羧基端在蛋白B降解中的作用 6 3.4.1 蛋白A氨基端与蛋白B降解 6 3.4.2 蛋白A羧基端与蛋白B降解 6 3.4.3 蛋白A羧基端与蛋白B泛素化 6 3.1 蛋白A降低蛋白B的表达量 3.1.1 蛋白A介导蛋白B降解 蛋白A是泛素蛋白酶体系统中的一个调节分子。前期研究结果显示，蛋白A可以调节蛋白B所在家族的某些分子的的泛素化和降解。为探讨蛋白A对于蛋白B的调节方式，构建质粒蛋白A-V5和蛋白A-HA，并将两种质粒分别转染HEK293细胞48小时后，收集细胞，采用Western blot方法检测其蛋白表达水平，结果如图3.1显示，两种质粒转染HEK293后，均可以下调HEK293细胞中内源性的蛋白B的表达。 3.1.2 蛋白A降解蛋白B的特异性 为探讨蛋白A介导蛋白B降解的特异性，我们将其他三种蛋白A的家族蛋白X、Y、Z转染HEK293细胞48小时，采用Western blot方法检测其蛋白B表达水平，结果如图3.2显示，X、Y、Z不能介导蛋白B的降解。 3.1.3 蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性 检测蛋白B在若干肿瘤细胞中的基础表达。选择无内源性蛋白B的表达的细胞系（Cell 1），采用该细胞系检测过表达蛋白B的稳定性。将蛋白B细胞共同转染蛋白A-V5/HA，结果显示，蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性。 接下来为进一步检测蛋白A可以下调蛋白B的表达，我们设计了三种不同的蛋白A shRNA（#1、#2、#3），并将其转染Cell 1细胞48小时，结果显示，sh蛋白A可以增强蛋白B的表达，进一步验证了实验结果。 3.1.4 蛋白A调节蛋白B稳定性 为研究蛋白A介导蛋白B降解是否是因为其干预编码蛋白B的 分子的mRNA的表达，本实验采用RT-PCR方法，检测蛋白A对蛋白BmRNA表达量的影响。将HEK293细胞分别转染空质粒或者蛋白A-V5质粒，提取RNA，而后设计蛋白B引物行RT-PCR检测。结果显示，蛋白A对蛋白B的mRNA的表达无影响，证实蛋白A介导蛋白B降解是通过调整其蛋白质的稳定性。 3.2 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统 3.2.1饥饿状态诱发蛋白B降解 在研究蛋白A介导蛋白B降解的过程中，我们发现Cell 1细胞转染蛋白B-V5质粒后，将细胞处于饥饿状态（FBS-free