第06章-常用分子生物学技术.ppt

第六章 常用分子生物学技术 主要内容： 1.分子杂交技术 Southern、Northern、Western blotting；原位杂交、生物芯片 2.目的基因制备技术 PCR、cDNA文库、化学合成 3.基因敲除技术 4.RNA干扰技术 第一节 分子杂交技术 分子杂交技术是利用生物分子之间的相互作用（单链核酸碱基互补配对，抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子），进行目的核酸、蛋白质检测，广泛应用于基因重组、生物印迹示踪、生物芯片等领域，具有高特异性、高灵敏性、高通量等特点的技术。 方法；目的；应用；特点四方面。 一、核酸的分子杂交 核酸的酸碱性质和溶解度性质：核酸有磷酸基和碱基，为两性分子，但偏酸性。不溶于乙醇或异丙醇。 核酸的紫外吸收：OD260 核酸杂交的原理是核酸的变性和复性 变性：在某些理化因素下（过量酸、碱，加热，变性剂如尿素等），DNA双链解成单链过程。 本质是双链间的氢键断裂。 复性：在适当条件下，变性的DNA两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。 核酸的分子杂交（重点） 核酸的杂交：序列互补的单链核酸根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。 生物素 生物素(biotin)是一种水溶性维生素，又名维生素H。 MW 244.31kD。 能与一种碱性蛋白—抗生素蛋白高亲和结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。生物素经活化后易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）已在整个生物学领域中得到广泛应用 Blotting印迹技术 §印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 § Southern印迹法：1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 §而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 1.Southern印迹 （2）Northern印迹 Northern印迹 Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。 （3）Western印迹 蛋白质印迹流程： ①蛋白质样品制备，作为抗原。 ②SDS分离样品 ③转膜 ④固定在膜上蛋白质作为抗原，抗原抗体（一抗）结合 ⑤加入酶偶联或放射性同位素标记二抗，显色或放射自显影检测蛋白质。 常用的抗体： 1.放射性标记的抗体 最早使用，定量最准确的方法。已逐渐被非放射性检测系统取代。 2.与酶偶联的抗体 酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP) 。 显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB；呈棕黄色 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT; AP最敏感的底物，呈紫色 3与生物素偶联的抗体 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名维生素H。 MW 244.31kD 能与抗生素蛋白高亲和结合。生物素经恬化后易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）已在整个生物学领域中得到广泛应用 （4）原位杂交 5).科学技术的重大变革：生物芯片技术 美国《财富》杂志曾载文指出，在20世纪科技史上有两件事影响深远： 一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭； 另一件事就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。 什么是生物芯片(Biochips)？ 生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。 目前,生物芯片技术已经成为人们高效、准确、大规模地获取相关信息的重要手段之一,在生物、医学、农业、食品、环境科学等领域具有十分广阔的应用前景。 有三类： 微阵列芯片 微流控芯片： 芯片实验室 根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。 目前, 最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的基