耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究.docVIP

PAGE PAGE 1 耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究 　　摘要：为了确定耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶的抗原性质较野生型甲型流感病毒是否发生改变，利用原核表达方法在大肠杆菌中大量表达并纯化野生型甲型流感病毒H3N2的红细胞凝集素（HA）和神经氨酸酶（NA）；取HA和NA免疫后的小鼠血清分别对野生型和突变型甲型流感病毒H3N2进行Westernblotting、ELISA以及中和抗体检测。结果表明，野生型甲型流感病毒以及第119位氨基酸单点突变型甲型流感病毒对HA和NA免疫后的小鼠血清都有很好的免疫反应性，而第222位氨基酸单点突变和双点耐药突变型甲型流感病毒对免疫血清的免疫反应性要低很多。该研究首次确定了甲型流感病毒H3N2的野毒株与耐药突变株的神经氨酸酶的抗原性质存在很大的差异，进一步表明耐药突变株病毒除了具有抗药物活性之外也具有逃逸机体所产生的抗体攻击的能力，可为将来新一代甲型流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供重要参考。 　　关键词：甲型流感病毒H3N2；耐药性；神经氨酸酶；点突变；免疫原性 　　中图分类号：R392.7文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）03-0613-05 　　病毒通常会采用不同的策略来逃逸机体的免疫攻击，因此研究病毒逃逸机制以及设计合理的方法来抑制病毒的逃逸，是目前疫苗研究的主要手段。其中病毒一个重要的逃逸机制就是遗传突变，改变其自身表面主要抗原的空间表位，从而使机体免疫系统不再识别并产生作用，达到躲避机体免疫的目的[1-5]，使得免疫系统和疫苗无效，病毒得以大量繁殖。 　　甲型流感病毒H3N2表面有两个主要的糖蛋白：红细胞凝集素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）。这两个蛋白编码基因都具有不同程度突变功能，通过引入新的突变，形成新的亚型病毒株来躲避机体免疫系统。HA通过结合细胞膜上的唾液酸受体从而介导病毒内吞进入细胞[6]。NA通过切割新生病毒和细胞多糖末端唾液酸，有利于新形成的子代病毒颗粒从感染细胞中释放出去[7]，因此NA的抗体可以通过与NA特异性结合使NA的活性丧失，从而抑制新生甲型流感病毒的释放，间接地达到中和甲型流感病毒的作用[8]。 　　目前，有临床研究表明某些突变型甲型流感病毒H3N2具有抗奥司他韦的能力，发现其NA上的两个关键的氨基酸位点（第119和222位氨基酸）对病毒的抗药性起到了重要的作用，其中，第119位氨基酸由E突变为V，而第222位氨基酸由Ⅰ突变成了L[9]，而且只有两点同时突变的情况下才具有明显的抗奥司他韦活性，但是不清楚该两点的突变是病毒迫于药物的压力还是迫于机体免疫力（主要为病毒中和抗体）的攻击而产生的。为了解释这一问题，本试验对病毒突变前后NA的抗原性质进行了比较，若病毒NA在突变前后抗原性质未发生改变，可以推测该突变是病毒迫于药物的压力而产生的；反之，则认为突变是病毒迫于机体免疫攻击或是迫于药物和机体免疫攻击的总压力而产生的。以上问题的阐明可为将来新一代甲型流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1基因、质粒、菌株及毒株 　　野生型甲型流感病毒NA和HA截短型基因（均截去3′端150bp）由吉林农业科技学院生物工程实验室构建；原核表达载体pET-32a（+）、大肠杆菌BL21、DH5α为吉林农业科技学院生物工程实验室保存；选用甲型流感病毒H3N2中国吉林流行株（GenBank：GU215036.1）为源病毒；NA第119位氨基酸单点突变、第222位氨基酸单点突变以及双点突变型甲型流感病毒H3N2由吉林农业科技学院生物工程实验室包装并在MDCK细胞中传代培养。 　　1.2试剂 　　地高辛（NBT）和生物素（BCIP）购自北京鼎国公司；辣根过氧化物酶HRP标记抗鼠IgG购自晶美生物公司；碱性磷酸酶AP标记的抗鼠IgG购自中山生物科技有限公司；野生型甲型流感病毒HA和NA鼠源抗血清由吉林大学人兽共患病实验室馈赠；蛋白Marker、质粒小提试剂盒等购自TaKaRa公司；Ni-NTAAgarose为Qiagen公司产品。 　　1.3HA和NA截短型基因的原核表达及纯化 　　诱导表达和表达产物的提取按Novagen公司的pET-32a表达系统操作手册进行，由于HA和NA为包涵体表达，故用Ni-NTAAgarose按Qiagen公司说明书纯化包涵体，PBS透析复性。 　　1.4Westernblotting法定性检测HA和NA抗血清对野生型和突变型甲型流感病毒的免疫反应 　　将野生型和突变型甲型流感病毒液用蛋白裂解液裂解，煮沸变性15min，12000r/min离心15min后，取10μL进行SDS，电泳完毕