酶的纯化方法.pptVIP

第二章 酶的生产与分离纯化 主要内容 国内外酶制剂工业生产及应用现状 酶的发酵技术 酶的分离纯化 1 国内外酶制剂工业生产及应用现状 1.1 酶制剂的生产及新技术的应用 ： 酶制剂的生产的三种方法： 组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶 微生物发酵：最大量的来源 化学及生物合成：生物重组 高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥、微胶囊 1.2 集中垄断，市场全球化： 规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90% 丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）→1978年进入中国诺维信公司，占50%市场（兼并天津酶制剂厂）； 美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡），两家公司销售额占全球2/3；（2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）； 芬兰科特公司和丹麦丹尼斯克公司酶制剂业务合并。 帝斯曼（DSM），巴斯夫(BSF) Pfizer，Rhone，SKW , Biosystems，日本天野 1.3 品种、规模不断扩大 目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。 我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。 国际以液体、颗粒为主。 国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%，显然不合理。 重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产; 我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。 1.4 应用领域不断扩大： 美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。非食品工业用酶市场份额逐渐扩大。 2 酶的发酵技术 利用微生物产酶的优点是： (1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。 (2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。 (3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。 (4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，没有季节性，经济效益高。 (5) 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。 2.1 微生物发酵生产酶的步骤 2.2产酶微生物 菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。 自然界中发现的酶有数千种，经过筛选用在工业发酵生产酶的微生物有50-60种，目前在酶的生产中，绝大多数的微生物酶仅由25种左右的微生物来生产的。 其中霉菌家族占了12种，如青霉、黑曲霉、米曲霉，其次是枯草芽孢杆菌，被称为是最有用的产酶微生物。 2.3 培养基的选择 （1）碳源 碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。 有机碳的主要来源有： 一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料； 二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中12～16碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。 不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。 （2）氮源 氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种。 常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等； 无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3%的无机氮源。 （3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶) 生产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75 %、玉米粉0.625%、鱼粉0.625