质粒DNA的提取与酶切鉴定2.pptVIP

2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。 其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为 5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` (2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： 试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0； 5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。 四、碱裂解法小量制备质粒DNA 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时； 2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3、加入100?L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解 4、加入200?L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀内容物,冰上放置3－5min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构 5、加入150?l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 质粒图谱: 五、 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳 1、在1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于1.5ml离心管中 提取质粒DNA 4.0 ?L 10× buffer H 1.0 ?l EcoR I 1.0 ?l （2.0 U） dd H2O 4.0 ?L 10 ?L 1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在20 ?L 反应液中反应1h，使1 ?g DNA完全消化所需的酶量. 2、轻轻混匀, 4000g离心10秒 ，置于37℃水浴中酶解2-3h。 3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。 七、思考题 1、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？ 2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用