微生物实验指导书-.docVIP

PAGE PAGE 1 微生物学 实 验 指 导 书  目录 TOC \o 1-3 \h \z \u 实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术 3 实验二 培养基的配制 8 实验三 从土壤中分离微生物及纯化 11 实验四 微生物的接种技术 14 试验五 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 17 实验六 细菌的简单染色和革兰氏染色 20 实验七 大肠杆菌生长曲线的测定 23 实验八 实验室环境和人体表面微生物的检查 25 实验九 乳酸菌的检测 28  实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术 【目的要求】 1. 学习并掌握棉塞制作的目的、原理及方法； 2. 学习并掌握玻璃器皿清洗及包扎方法； 3.掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。 4.了解其它常用消毒灭菌技术原理及技术 【基本原理】 棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较大的影响。 微生物学实验所用的器皿，大多数要进行清洗、消毒、灭菌，才能用来培养微生物。玻璃器皿的包扎方法正确合理，在使用过程中才能有效防止杂菌的污染。玻璃器皿包扎好后，一般用高压蒸气灭菌法进行灭菌。 高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到100℃以上的高温，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此外，常见灭菌方法还有干热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使用甲醛加高锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌方法。 【实验用品】 棉花，试管，培养皿，纱布，三角瓶，棉线，量筒，牛皮纸（或旧报纸），LDZX-50KBS立式高压蒸气灭菌锅，常用灭菌用具、药剂等等。 【方法步骤】 一、棉塞的制作 正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。制作过程见图1，包括取棉花、整理、折角、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。 图1 棉塞制作过程 做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞，即用几层纱布（一般8层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生长或发酵，通气塞的形状如图2。 A. 配制时纱布塞法；　B. 灭菌时包牛皮纸；　C. 培养时纱布翻出 图2通气塞 二、玻璃器皿的清洗 1. 不能用有腐蚀性的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。 2. 用过的器皿应立即洗涤。 3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。 4. 含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。 5. 一般的器皿可以用去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器皿应先将油脂擦去。沾有煤膏、焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、汽油、丙酮等）揩去。 6. 载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡2 小时，用清水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。 7. 洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。 三、玻璃器皿的包装 1. 培养皿的包装 A. 内部框架　B. 带盖外筒图3 培养皿 A. 内部框架　B. 带盖外筒 图3 培养皿金属灭菌筒 框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。 2. 移液管的包装 准备好干燥的移液管，在距其粗头顶端约0.5 cm处，塞约1.5 cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑），接着按图4方法包扎，后将移液管集中在一起，用一张大报纸包好，进行干热或湿热灭菌。 图4 移液管的包扎方法与步骤 3. 试管和三角瓶的包扎 试管管口和三角瓶瓶口塞上棉花塞或硅胶塞后，再用双层报纸包扎好（如有牛皮纸，效果更好），进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般7个或10个一组，再用双层报纸包扎。 四、灭菌及净化设备操作技术 （一）高压灭菌锅的使用 利用高压水