BDNF通过上调Ra寺b8GTP水平调控突触后膜AMPA受体的局部运输.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 CONTENTSAbstract CONTENTS Abstract in Chinese ．1 AbstraCt ．4 S肿bolic description ．．7 Introduction ．8 MateriaJs ．13 Methods ．．22 Results ．34 Discussion ．4l Figures ．45 Ref-erences ．58 Acknowledgement ．62 Achievements ．．63 万方数据 山东大学硕士学位论文BDNF 山东大学硕士学位论文 BDNF通过上调Rab8．GTP水平调控突触后膜AMPA受体的局部 运输 硕士研究生： 陈群 导 师： 黄淑红 专 业： 神经生物学 中文摘要 一、研究目的及背景 脑源性神经营养因子(Brain．derived neurotrophic factor，BDNF)作为神经营养 因子中的重要成员，不仅能促进神经元的存活与分化，树突和轴突的生长，而且在 调节突触可塑性过程中起到关键作用。突触可塑性通常被认为是学习与记忆的分子 基础，在神经元信息传递过程中发挥重要的调控作用。在突触前膜，BDNF通过调 控膜泡分泌促进递质释放实现对突触前膜可塑性的调节；而在突触后膜，BDNF往 往是通过调控离子型谷氨酸受体， 特别是 AMPA 受体 (Alpha-amino．3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptors)的分布和数量 来实现对突触后膜可塑性的调控。树突棘(spine)是神经元的特化结构，分布于神 经元的树突上，一般呈蘑菇头状。树突棘中有突触后致密质，是突触后膜的特化结 构，树突棘可以与突触前膜和突触间隙组成一个完整的突触结构，介导化学信号的 传导。虽然已有文献报道BDNF可以上调AMPA受体在神经元整体膜表面的含量， 但是BDNF是否能调控AMPA受体在spine部位的膜表面含量，还有待进一步研究。 小GTP酶蛋白中的Rab家族参与细胞内的膜泡运输过程，那么Rab分子是否 也能参与调控突触后膜，特别是spine处细胞内的膜泡运输过程呢?目前研究报道 Rab8参与调控细胞内膜泡从高尔基体TGN区运往细胞膜的过程，对神经元的极性 运输起着关键作用。且有研究证实，Rab8在AMPA受体运往spine膜表面的过程中 是必要的，特别是在AMPA受体上膜的过程至关重要。然而，在BDNF调控AMPA 受体在突触后膜的运输过程中，Rab8是否参与以及如何发挥作用，目前尚不清楚。 本文采用分子细胞学方法证实BDNF能够通过增加Rab8．GTP的含量从而特异性上 调GluAl(AMPA受体的一种亚基)在spine膜表面的分布，而且这个过程是由 PLCY．Rabin3信号介导实现的。本研究将为人们阐明学习与记忆的具体分子机制提 供一个新的角度。 万方数据 山东大学硕士学位论文二、实验方法 山东大学硕士学位论文 二、实验方法 1．各种表达质粒的构建。 2．海马神经元的培养及其转染。 3．免疫荧光定量检测AMPA受体在spine处的膜表面水平。 4．胞浆蛋白与膜蛋白的分离。 5． GST．pull down及WeStem Blo连。 三、实验结果 1．BDNF调控GluAl在spine处的膜表面水平。 通过免疫荧光的实验方法，我们发现给予培养神经元BDNF刺激30 min，不仅 能够显著升高spine处GluAl蛋白的整体水平，同时还能上调spine膜表面GluAl 蛋白的含量。 2． BDNF不影响GluA2在spine处的膜表面水平。 通过免疫荧光的实验方法，我们发现给予培养神经元BDNF刺激30 min，虽然 能够显著升高spine处GluA2蛋白的整体水平，却不影响spine膜表面GluA2蛋白 的含量。 3．BDNF通过影响Rab8形式转换上调GluAl在spine膜表面的分布。 通过免疫荧光的方法，我们发现在过表达Rab8功能缺失突变体(Rab8dn)后， BDNF不再上调GluAl蛋白在spine膜表面的含量；过表达Rabll功能缺失突变体 (Rablldn)后，BDNF不能上调spine处GluAl蛋白的整体水平。 4． BDNF上调Rab8．GTP水平。 通过胞浆一膜蛋白分离及GST puU do、Ⅳn两种实验方法，我们发现给予培养神经 元BDNF刺激30 min后能够显著上调神经元中I汕8．GTP的蛋白水平。 5．BDNF通过Rabin3蛋白上调Rab8．GTP的蛋白水平。 通过GST_JFCl pull dowrll方法，我们发现干扰掉Rabin3后，BDNF不再上调 Rab8．GTP。 6． BDNF通过1’rkB．PLC丫