BDNFTrkB通路在海马脑片培养卧中的神经再生研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 博士学位论文增殖和神经再生增加，这被认为是神经元丢失的补偿机制。缺血诱导的神经再 博士学位论文 增殖和神经再生增加，这被认为是神经元丢失的补偿机制。缺血诱导的神经再 生机制仍不甚明了，需更多证据阐明。OHSCs系统是研究缺血诱导的神经再生 的方便而可靠的工具。离体研究中，可以用氧葡萄糖剥夺技术(OGD)对OHSCs 造成类似于缺血引起的损伤。本研究中，我们首次设计了一系列实验来证实 OGD诱导的神经再生。缺血诱导损伤的强度与神经再生程度是否有关仍未确 定，我们对培养脑片施以不同持续时间的OGD来诱导出正常、轻度及重度损 伤，试图明确损伤强度和缺血诱导神经再生之间的关系。鉴于BDNF—TrkB信号 对控制缺血诱导神经再生的重要性，我们进一步监测了OGD诱导损伤后BDNF 和TrkB在OHSCs的表达，了解神经元损伤后BDNF．TrkB信号的变化及其与 神经再生的相关性。 动物 本研究所用C57BL小鼠来自于广东省实验动物中心。所有操作及饲养均遵 循人道原则尽量减少动物的痛苦及使用数量。符合广东省实验动物管理条例并 通过实验动物伦理委员会审核。 脑片培养 海马脑片培养准备如既往研究所述，并稍做改进。取产后6天幼鼠，断头 取脑，分离海马，迅速置于预冷的人工脑脊液(aCSF)中。此液配方为：NaCI 118 mM，KCI 2．5 mM MgS04 3 mM，NaH2P04 1．1 mM，NaHC03 26 mM， CaCl2 l mM和葡萄糖11 mM(所有试剂购自美国Sigma公司)，置于95％ 02／5％C02饱和气体中。随后，用切片机(MA752，Campden仪器公司)切400lain 厚冠状切片，取相邻的背侧海马冠状切片，每个培养板中放入1-2片以待培养。 在体视显微镜下，将浸泡于预冷、氧合Hank’s平衡盐溶液(Gibco， Invitrogen 公司)中的海马切片仔细分离，将没有明显损坏的脑片移至无菌多孔滤膜 111 万方数据 摘要Millicell(Millipore 摘要 Millicell(Millipore公司)，无血清培养基由50％MEM，18％HBSS，4 mM L- 谷酰胺， 12 mM葡萄糖， 4．5 mM NaHC03， 20 mM蔗糖， 100 U／mL青霉 素和100 mg／mL链霉素组成(所有试剂均购自Gibco或Sigma公司)。从每个海 马中挑选部位匹配的脑片，随机分配到不同的培养条件组。由培养液中所用重 组人BDNF(Immunological Sciences公司)和BDNF拮抗剂K252a(50 nM，Sigma 公司1或TrkB-IgG(299／mL， RD系统，)的不同浓度进行分组。 碘化丙啶(PI)标记 碘化丙啶(PI)是经典的细胞活性探针，在细胞膜破裂后进入细胞与DNA 结合发出红色荧光。OGD处理后24小时，培养基内给予20 pg／mL PI，5分钟 后在荧光显微镜下观察并照相，以观察神经元受损死亡程度。 BrdU处理 为即时标记有丝分裂后细胞，我们对DNA合成标记物BrdU的处理方法大 致遵照传统方式并略做改进。为确定合适的BrdU方案我们使用两种改进办法： 第一种方法为在脑片制备30分钟前对活体动物进行单次的给药，将BrdU溶解 在0．9％NaCI中，以50 mg／l(g的剂量腹腔注射到幼鼠体内，此后脑片无需进行 二次BrdU处理。第二种方法为BrdU处理两次。先将BrdU注射到老鼠体内， 然后在在脑片体外培养阶段给予O．5 uMBrdU处理3天(DIV 0至DIV 3)。 氧葡萄糖剥夺(OGD)处理 常规OGD处理：OGD处理液由10 mM的甘露醇代替原有的培养基。在 OGD处理前，OGD培养基加入6孔板，用95％N2和5％C02混合气体预饱和， 并37。C预热。在正常培养的第8天(DIV 8)，将海马脑片从无菌室中转移至预 热的OGD培养基，并置于一个密封箱内，予95％N2和5％C02混合气体通气 10分钟。箱密封后置于37。C孵育40分钟。40分钟后，重新置于原有培养基中 继续培养。对照组使用正常培养基。 IV 万方数据 博士学位论文免疫组织化学染色 博士学位论文 免疫组织化学染色 在体外培养第16天(DIV)，在室温条件下将培养脑片固定在4％PFA 1小 时，然后转移到30％蔗糖溶液中孵育24小时。随后将脑片置于37℃2 M HCI 30分钟，在硼酸(0．1 M，pH 8．5)液中冲洗lO分钟。然后将脑片在PBS中彻底 洗净，用5％2羊血清与5％牛血清白蛋白封闭30分钟。做免疫组化：将脑片 与羊抗BrdU抗体(1：50，Sigma公司)，鼠抗NeuN抗体(1：50，Chemicon公 司)或鼠抗GFAP(1：200，Sigma