候选调控蛋白S100A11多层次介导TGFβSmad殿信号通路促进结直肠癌的转移.docx

硕士学位论文源性LASPl后检测S100A11蛋白及mRNA的表达，激光免疫共聚焦、免疫共 硕士学位论文 源性LASPl后检测S100A11蛋白及mRNA的表达，激光免疫共聚焦、免疫共 沉淀等方法检测LASPl与S100A11蛋白水平的相互作用； 2、TGF[3处理细胞从形态学及分子表型观察其诱导EMT发生，检测下游 蛋白LASPl、S100A1 1的表达及Smad信号通路的激活，沉默LASPl、S100A1 1 的表达，探讨其在TGFl3介导EMT过程中的关键作用； 3、免疫组织化学检测临床结直肠癌组织样本(含完整临床及随访资料)中 S100A11的表达，冰冻切片免疫荧光观察s100A1 1亚细胞定位，分析 S100A11不同的亚细胞定位表达与临床病理学参数及预后的关系； 4、引入核定位和核输出信号改造S100A11重组载体，构建不同亚细胞定 位的过表达S100A1 1细胞系，RNA干扰技术沉默S100A11的表达，从体外 水平观察结直肠癌细胞生物学行为的影响，探讨其在EMT发生过程中的作用； 5、构建不同亚细胞定位的稳定过表达s100A1 1细胞系，免疫印迹和免疫 荧光鉴定稳定株构建成功，从体内外水平观察结直肠癌细胞生物学行为的影响， 探讨其在EMT发生过程中的作用； 6、利用免疫共沉淀联合质谱鉴定技术，筛选并构建S100A11胞浆内相互 作用的信号分子及在细胞核内相互作用的转录调控因子，合成特异性siRNA， 探讨其对肿瘤生物学行为及信号通路的作用，敲除候选靶蛋白的表达分析其在 TGFB．LASPl．S100A11介导的生物学功能中的作用，明确S100A11胞浆和胞核 水平的双重调控机制在肿瘤恶性生物学行为中的作用； 统计学分析： 使用SPSS 19．0统计学软件对数据进行分析(SPSS Chicago，USA)，定量数 据为3次独立实验结果汇总用均数4-标准误表示。两组间数据的比较使用独立 样本T检验，多组间数据的比较使用One．way ANOVA。CCK8数据用析因设 计资料的方差分析。S100A1 1与临床病理学参数之间关系用Pearson’S chi-squared(矛)检验；Kaplan．Meier生存曲线用来统计S100A11单因素变量预 111 万方数据 摘要后相关分析，多因素变量分析用Cox比例风险回归。P0．05为差异具有统计学 摘要 后相关分析，多因素变量分析用Cox比例风险回归。P0．05为差异具有统计学 意义。 结果： 1．LASPl在蛋白水平通过蛋白质相互作用正向调节S100All的表达 1．1 LASPl正向调节S100All蛋白水平的表达 为验证前期蛋白质组学筛选的结果，在细胞水平，将结直肠癌细胞系 SW480和HCTll6中导入LASPlcDNA， siRNA介导的RNA干扰SW620 和HCTl 16中LASPl的表达，通过实时荧光定量PCR、Western Blot和免疫 荧光共聚焦分别检测S100A1l mRNA或蛋白水平的表达。PCR结果显示 LASPl不影响S100A11 mRNA表达水平(P0．05)、Western Blot显示LASPl 调节S100A11蛋白水平表达、免疫荧光共聚焦发现LASPl与S100A11蛋白 水平表达正相关，并存在共定位情况；在组织学水平，利用免疫组织化学方法 检测50例石蜡包埋组织中LASPl和S100A11蛋白的表达，统计学分析二者 表达正相关关系(R--0．445，P=0．004)。 1．2分析LASPl和S100All的相互作用 鉴于前者免疫荧光共聚焦结果，我们再次利用COIP实验正向反向验证 SW620、HCTl 16细胞中LASPl与S100AI 1结合情况，结果显示：LASPl 与S100A11存在结合作用。 2．LASPl通过S100All介导结直肠癌细胞的侵袭性表型和EMT 2．1 LASPl通过S100All介导结直肠癌细胞的侵袭性表型 为了检测S100A11在LASPl介导的细胞侵袭性表型的变化，我们进行了 恢复实验。首先分别设立BLANK、NC、LASPl、LASPl+si．S100A11组；BLANK、 NC、si．LASPl、si．LASPl+S100Al 1组，用Transwell实验验证S100A1 1对LASPl 介导的细胞迁移能力的影响。我们发现SW480、HCTll6细胞中同时过表达 LASPl和敲低S100A11后可明显抵消细胞中LASPl介导的迁移能力(P0．05)， 万方数据 硕士学位论文而同时干扰LASPl和过表达S100A11后可明显恢复细胞的迁移能力(PO．05)。 硕士学位论文 而同时干扰LASPl和过表达S100A11后可明显恢复细胞的迁移能力(PO．05)。 2