第6章节dna的重组跟转座资料教材.pptVIP

重组DNA技术 DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。 限制性内切酶的发现 限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 限制性内切酶的命名原则 命名原则： 取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 限制性内切酶分类 限制性核酸内切酶可分为三大类： I类 II类* III类 I 类限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 代表EcoB、EcoK II 类(型)限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。 III类(型)限制性内切酶 有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。 很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值。 限制性内切酶产物 钝端（平端） 粘性末端 酶切反应 1）加入DNA； 2）加入Buffer； 3）加入酶； 4）37℃保温1hr或过夜； 5）反应终止，65℃加热、加入EDTA、或加入苯酚。 浓缩的限制性内切酶用1×限制酶缓冲液稀释。 限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。 尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。 在切割大量DNA时，通常延长时间可使所需的酶量减少。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。 注意星号酶切活力。 星号活性：限制性内切酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性降低，即可以把原来识别的特定的DNA序列不同的碱基切断。 星号活性出现的频率、根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都有星号活性。 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（Vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 重组DNA的主要载体 质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。 质粒载体特点 1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 遗传标记基因 标记基因的作用: 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞; 　 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 　 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 重组DNA载体的选择 选择载体的几个重要参数 （1）实验对象 （2）实验性质 （3）载体容量 （4）合适克隆位点 （5）载体的稳定性 （6）载体DNA制备的难易 （7）外源基因表达产物产量、产物特点等 载体容量 M13mp载体 4 kb 细菌质粒载体 10kb λ载体 23kb COS质粒载体 48kb P1载体 95 kb pYAC载体 ∽1000 kb 合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点 载体分类 按功能分 1. 克隆载体; 2. 表达载体. 按宿主性质 1. 原核载体: 质粒载体、粘粒、噬菌