丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和.pptVIP

产 L -丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和代谢流分析 * L -丝氨酸 L -丝氨酸在生物体生理和代谢过程中具有不可替代的作用: 1）它可以为哺乳动物中枢神经系统的生 长和发育提供营养 2） 它还是胞内多种重要生物物质合成所需的一碳单位(C 1 units)的直接供体, 参与氨基酸、嘌呤、嘧啶、磷脂等的合成 . * 本研究采用系统代谢工程策略, 构建了基因工程菌 Corynebacterium glutamicum SER-8. 连续补料发酵实验显示, SER-8 的比生长速率降低,L -丝氨酸的积累量在不同的生长时期呈现变化. 代谢流分析证明, 过表达 3-磷酸甘油酸激酶使糖酵解途径和三羧酸循环增强, 过表达脱敏型 3-磷酸甘油酸脱氢酶加强了 L -丝氨酸合成途径.敲除激活蛋白GlyR部分减弱了 L -丝氨酸向甘氨酸的转化, 代谢流比率仍有38.2%. * 首先, 糖酵解的代谢中间产物 3-磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH, serA 编码)的作用下氧化为 3-磷酸羟基丙酮酸; 然后在转氨酶(PSAT, serC编码)的作用下3-磷酸羟基丙酮酸与谷氨酸之间进行 氨基的转移, 形成 3-磷酸丝氨酸; 最后在磷酸丝氨酸磷酸酶(PSP, serB 编码)的作用下 3-磷酸丝氨酸水解生成 L -丝氨酸. L-丝氨酸在 C. glutamicum 中通过磷酸化途径合成过程 * 实验过程 1）质粒和菌株构建 2）摇瓶和发酵罐发酵 3）胞内代谢物测定——样品预处理、淬取和抽提 4）分析 * 基因敲除. 使用含 sacB 反筛标记的自杀载体进行基因组上目的基因的无痕敲除 (2)基因过表达. 为增加 L -丝氨酸合成的体供应量, 构建了分别含有 pgk 和 serA r 的单基因表达载体. * 种子摇瓶培养: 将 BHI 斜面活化的菌体接入含有50mL种子培养基CGIII的三角瓶中, 在30℃, 200r/min下振荡培养到对数生长期, 菌体密度达到12. 发酵摇瓶培养: 接种量为 1 mL, 500 mL 挡板三角瓶装液量为 30 mL, 添加 2%碳酸钙. 发酵在 30℃,120 r/min 下培养 72 h. 补加浓氨水调节发酵液的 pH在 7.0~7.2 之间. 7.5 L 罐发酵培养: 接种量为 3%, 装液量为 2 L,温度控制在30℃, 自动流加浓氨水控制pH在7.2, 溶氧维持在 30%以上. 初始葡萄糖为 20 g/L, 当残糖低于10 g/L 时, 流加 400 g/L 的葡萄糖. 发酵连续进行60 h. 当A 600 =2时, 加入0.8 mmol/L IPTG诱导重组质粒携带的基因表达. * 7.5 L 发酵罐发酵培养至菌体生长的对数生长期中期抽取 5 mL 发酵液, 注入 20 mL 淬取剂中(60%甲醇, 70 mmol/L Hepes, -80℃预冷),于20℃, 5200×g离心 10 min, 倒掉上清, 菌体保存-80℃ . 采用高温煮沸释放内含物的方法抽提胞内代谢物. 将菌体在 90℃加热 5 min, 连续进行 3 次抽提 . 抽提后放置室温, 用真空泵风干.加入 500 μL无菌蒸馏水溶解内含物, 5500×g 离心 10 min, 上清保存于-80℃ .为了减少菌株 SER-8 与对照 SER-0 之间取样的差异提高数据准确度, 选用在 CGX 基本培养基,初始葡萄糖浓度为 40 g/L 的批次发酵的样品进行胞内代谢物的测定. * 生物量测定 葡萄糖浓度测定 L -丝氨酸含量测定 * 结果讨论 本实验结果显示敲除激活蛋白 GlyR, 在一定程度上可以降低 L -丝氨酸转化为甘氨酸, 但该通路代谢流比率分配仍有 38.2%, 进一步印证了SHMT 催化的 L -丝氨酸转化为甘氨酸是限制 L -丝氨酸积累的关键节点. 本研究进一步证明增加前体物供给有助于提高 L -丝氨酸的生物合成. 本实验结果表明胞内 L -丝氨酸的代谢对维持 C. glutamicum 的生长 至关重要. * 展望 本研究结果不仅为未来 L -丝氨酸代谢工程改造提供了新的靶点, 而且能够对 C.glutamicum 利用葡萄糖直接发酵法生产 L -丝氨酸提供科学前提和研究基础, 从而为工业微生物菌株的选育提供新的思路. * * .