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补体的测定及临床应用 补体是一组存在于人和脊椎动物血清中具有酶样活性、不耐热的糖蛋白 补体不是单一成分，在功能效应上是以连续反应的程序进行的，故又称补体系统 补体系统由补体固有成分、补体调节蛋白和补体受体组成 补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，含量相对稳定，但某些疾病时，含量及其活性可发生改变 补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾病的诊断具有重大意义 补体的含量 补体大多为糖蛋白，属于?球蛋白 正常血清中补体各组分含量相差较大，其中C3含量最高。 补体主要在血液和肝脏中进行代谢，代谢率快，每天更新一半 补体的理化特性 补体性质不稳定，容易受各种理化因素的影响 补体标本保存在-20℃ 补体的活化途径 1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式 2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时产生的MBL和C反应蛋白等 3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御。 在机体感染的过程，首先活化和发挥作用的是旁路途径和MBL途径，在特异性抗体产生时，经典途径才可发挥作用 补体总活性测定 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称CH50.CH50通常是指CP-CH50（经典途径） CH50的测定方法 原理 应用绵羊红细胞（SRBC）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关（特殊的S性关系）。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性 CH50测定方法 1、红细胞浓度的调整 绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4℃保存备用。使用前，调制成2%～5% SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入20～30倍的稀释液，在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。 2、溶血素滴定 溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化 试验前需先行加热56℃ 30min或60℃ 3min以灭活补体 溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用 自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用2个单位。 溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定 3、稀释缓冲液 磷酸缓冲液等 PH7.2-7.4 加入适量NACL,保存等渗 Ca2+、Mg2+ 50%溶血标准管 CH50的计算 CH50(U/ml)=1/血清用量×稀释倍数 不同的CH50测定方法，其活性参考范围不一样，一般以反应总体积2.5ml为常用，参考范围50-100U/ml. 方法学评价和临床意义 方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关 总补体活性的参考范围为50～100U/ml CH50增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 CH50降低见于： 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球肾炎等 单个补体成分的测定 常作为单个补体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等 测定方法： 免疫溶血法（检测单个补体成分的活性） 化学法（检测单个补体成分的含量） 自动化免疫散射比浊法 免疫溶血试验 试验依据：抗原抗体结合后可激活补体的经典途径，可导致细胞溶解 指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统 参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清 结果判度:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分活性呈正比，仍以50％溶血为终点 免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见 免疫化学法 免疫化学法分类 1.单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳 3.透射比浊法 4.散射比浊法 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰。后两种方法：通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个