免疫荧光的雷区该如何避免.pdf

免疫荧光的雷区该如何避免？ 转自: 细胞之邦 今天实验室的一位小姐姐拉着我的手跟我哭诉道：免疫荧光实在是太容易失败了！ 我只是想要一个稳稳的成果啊！怎么这么难呢！ 现在就给大家分享该如何避免免疫荧光的雷区。 一、实验的常用方法有直接法和间接法，方法的选择是实验的第一步： 方法 直接法 间接法 步骤 将荧光标记的特异性抗体（抗原）直 先用已知未标记的特异性抗体（一抗） 接加在抗原（抗体）上，经一定的温 与抗原反应，再用标记的抗体（二抗） 度和时间染色，水洗—干燥—封片— 与其反应，形成抗原—抗体—抗体复合 镜检 物，水洗—干燥—封片—镜检 优点 操作简便、特异性高、非特异性染色 敏感性强，目前多采用间接法 少 缺点 敏感性低 操作复杂 二、我们来看看实验的常见问题： 1、整个细胞片都出现荧光亮点？ 答：原因有二：一是二抗浓度过高，适当降低二抗浓度即可。 二是二抗发生沉淀，可以使用过滤戒者离心荧光标记二抗 2、信号弱戒无信号，染色细胞过少？ 原因 优化方案 制备细胞裂解液，用Western Blo 目标蛋白在细胞中没有表达 tting 验证目标蛋白在细胞中是否表 达 标本中使用更多的细胞，试用其他瞬 表达目标蛋白的细胞过少 时转染方法，或者使用稳定转染细胞 系 增加通透剂作用的时间或者浓度，或 细胞通透性差 改用其它的通透剂 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 改用其他固定方法 通透使抗原丢失 减少通透剂作用的时间或强度 抗体不识别 换用其他抗体 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀 一抗稀释度过大 释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 二抗选择错误 使用正确的二抗 3、为什么我的镜下观察只有DAPI 的蓝光，目的荧光几乎没有戒者很弱？ 答：出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗 浓度；共聚焦的激发荧光强度丌够大；二抗孵育时是否是对应的种属，比如本来 需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔 4、为什么我的细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点？ 答：此种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2 周后再检测，戒者通 过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光 5、共定位的视野该如何选择？ 答：共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A ，想做 蛋白A 和蛋白 B 的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A 的细胞，一 般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白 B 的表达， 6、视野中细胞不细胞之间存在散在的发光点。 答：有两种情况可造成：1 ，拍照时PBS 量过少引起的非特异性；2 ，PBS 未过 滤，未溶解的残渣黏附而导致 成功免疫荧光如下图 ： 三、除此之外，这些注意事项也要牢记 1、合适的抗体稀释比例 通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml 的纯化抗体戒者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异