实验室细胞培养基本知识课件.ppt

细胞培养箱的无菌 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。 细胞培养中的无菌操作 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。 移液：使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸管应始终位于工作区域内。 一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移液管、枪头、 注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），移液时避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘。 细胞培养中的无菌操作 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋紧。 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质，还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。 试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开直立，但不能让手或其他物品在开口的容器或无菌吸管的上方往来。 倒出液体：任何时候都不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养基和试剂。 小结 保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在其中工作。 尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。 保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无菌面的偶然接触。 实验完毕后，保持工作区的干净整洁。 污染 化学污染：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂； 生物污染：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。 细菌：通常被细菌污染的培养物呈云雾状 (即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层薄膜。另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低。在低倍显微镜下可见，细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的293细胞 酵母：培养物被酵母污染后也会变得浑浊， 但pH 值变化极小，污染严重时 pH 值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒。图为293细胞被酵母污染。 霉菌：是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。 病毒：是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小，因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都十分困难。使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。 支原体：是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的最小的生物。由于体积极小 (一般小于 1 微米)，支原体的检测十分困难。可在培养物中持续存在造成慢性支原体感染，而不会导致细胞死亡，表现为：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集； MycoFluor支原体检测试剂盒：A固定细胞无污染，B固定细胞支原体污染，C活细胞支原体污染。 抗生素的使用 细胞培养时不应常规使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，这种轻度污染最终将发展成大规模污染，而且连续使用抗生素还会掩盖支原体感染及其他隐性污染。 另外，有些抗生素会与细胞发生交叉反应，干扰您研究的细胞过程。 抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤除。 如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。 细胞培养基本知识—获取细胞 您可以通过原代细胞建立自己的培养系，或者也可选择从商业供应商或者非盈利性供应单位 (即细胞库) 处购买已经建立的细胞系。 声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。 不建议从其他实验室借用细胞，因为这会带来很高的污染风险。 无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。 培养环境 物理化学环境：温度、pH 值、渗透压、O2 和 CO2 ； 生理环境：激素和营养素浓度； 培养方式：一种是使细