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线性 高灵敏度分离色谱图 25 pmol 氨基酸标准品 样品预处理 脱脂 去蛋白 蛋白质水解 样品稀释 过滤 脱脂 脂类组分会影响分析柱 使用弱极性溶剂 乙酸乙酯 氯仿 正己烷等 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤 除蛋白 蛋白组分会干扰氨基酸的分离 除蛋白试剂 酸性溶剂方法 有机溶剂方法 超滤方法 蛋白沉淀物必须采用离心 (3000 rpm, 5 min) 或过滤方法除去. 酸性溶剂方法 三氯乙酸 (5-10% 水溶液) 高氯酸 (0.1 - 1% 水溶液) 除去蛋白后, 通过加 NaOH or LiOH 以中和溶液 (溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.) 有机溶剂方法 乙腈 乙醇 聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。 如果采用有机溶剂方法, 进样量应尽可能小。 超滤方法 效率高 成本低 老鼠血清中游离氨基酸分析 牛尿中游离氨基酸分析 猪血粉中游离氨基酸分析 茶叶中游离氨基酸分析 蛋白质水解 (1) 高氯酸水解方法 6N - HCl 110C (N2氛围) 22 - 72 hours 色氨酸, 半胱氨酸,蛋氨酸分析不能用此水解方法 (可用其它方法). 天冬酰胺酸和 谷氨酸 转换成酸的形式。 蛋白质水解 (2) 碱水解方法 4N NaOH 110C (N2 氛围) 16 - 24 hours 这一方法用于色氨酸 蛋白质水解 (3) 过甲酸氧化方法 A/B=5/95 110C (N2 氛围) A:30% 过氧化氢 B:90% 甲酸 22 - 72 h 这一方法用于 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸分析 盐酸水解方法实例 从胰腺得到的胰岛素中 的水解氨基酸分析 氨基酸残留基团测定值和理论值比较 碱水解方法实例 意大利草中水解氨基酸分析 过甲酸氧化方法实例 人发中水解氨基酸分析 样品稀释 0.2N 柠檬酸钠缓冲液 (pH 2.2) 0.2N 柠檬酸锂缓冲液 (pH 2.2) 用于稀释样品 稀释后的最佳浓度约为 5 nmol/ml - 10 mmol/ml. 过滤 进样前应使用 0.45 mm孔径的滤膜 过滤样品 POWER038.PPT 氨基酸检测方法 氨基酸衍生化方法 柱后衍生 柱前衍生 氨基酸 衍生化后的氨基酸 试剂 色谱柱 检测器 色谱柱 检测器 氨基酸 试剂 色谱柱 检测器 柱后衍生 色谱柱 : 阳离子交换柱 试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器 柱后衍生化分离柱 阳离子交换柱 使用阳离子交换柱，峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。 蛋白质水解氨基酸 (45 min) 生物体氨基酸 (120 min) 茚三酮方法 伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸） 检 测 : 440nm ( 脯 氨 酸) or 570nm (primary) 反应温度 : 130 ℃ 反应速度 : 快 速 试剂稳定性 : 不稳定（ 必须冷藏） 衍生化产物稳定性 : 稳定 茚三酮方法 阳离子交换柱 UV/VIS 检 测 器 茚三酮试剂 130 ℃ 氨基酸 柱温箱 反应器加热器 OPA 方 法( 邻 苯 二 甲 醛) 伯氨基酸 检 测：荧光检测器 (Ex=350nm, Em=460nm) 反应温度： 室 温 反应速度： 快 速 试剂稳定性 : 较 差 衍生化产物稳定性： 较 差 脯氨酸和羟基脯氨酸分析 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化 次氯酸盐 氯胺－T OPA 衍生反应辅助试剂 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应 乙硫醇 2- 硫基乙醇 3- 硫基丙酸 ( 非挥发性) OPA 方 法 阳离子交换柱 荧光检测器 氨基酸 柱温箱 OPA 试剂 次氯酸盐 茚三酮方法和OPA方法比较 衍生化后的氨基酸 色 谱 柱 检 测 器 柱前衍生 色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) 试 剂 : OPA ( 荧光检测) FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV) 柱前衍生分离柱 反相色谱柱 (ODS) 使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短 蛋白质水解氨基酸 (20 min) 生物体氨基酸 (60 min) OPA Method(o-phthaldialdehyde) 伯氨基酸 检测 : 荧光检测器 (Ex=380nm, Em=420nm) 反应温度：室温 反应速度：快速 OPA柱前衍生化色谱图 生