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分子发光分析法 第一节 分子发光分析概述 第二节 荧光光谱法的基本原理 第三节 荧光分析仪器 第四节 荧光分析方法及其应用 第一节 分子发光分析概述 荧光（fluorescence）现象的第一次记录： 1575年，西班牙内科医生和植物学家N. Monardes，观察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。 第一次被提议用于分析： 1864年，Stokes 第一次用于分析： 1867年，Goppelsr?der根据 Al-桑色素配合物的荧光，建立 了Al 3+的荧光测定方法。 一、分子发光 当分子吸收一定的能量后，从基态跃迁到较高激发态，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光。，以此建立的分析方法称为分子发光分析法。 二、 分子发光类型 1. 按激发的模式不同 光致发光；化学发光；生物发光； 热致发光；电致发光；摩擦发光： 2．按分子激发态类型 荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的 S=0 ，2S+1=1, 处于单重态，用S0表示。 磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。 电子在跃迁过程中伴随着自选方向的改变 S=1 2S+1=3，三重 态，用T表示。 荧光分析法特点 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长；不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长。比较容易排除其它物质的干扰，选择性好。 实验方法简单； 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 其发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法 第二节 荧光光谱法的基本原理 一、荧光（磷光）光谱的产生 1、电子自旋的多重性 分子中的所有价电子自旋都是配对的，称为单 重态，用“S”表示； 分子中电子对自旋平行的电子态，称为三重 态，用“T”表示。 2、电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M = 2S + 1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；若分子中全部电子都是自旋配对的，S=0，2S + 1=1，单重态S；若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，S=1， 2S + 1=3，激发三重态T。 符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2分别表示第一和第二电子激发三重态。 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。 3、激发态→基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 辐射跃迁能量传递过程 荧光：10-7～10-9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长较长? ’2 ? 2 ? 1 ； S1 → S0 + hv 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态； T1 →S0 + hv S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 延迟荧光：T1~S1，由S1发出的荧光。 无辐射跃迁能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。 内转换：对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越 发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。 但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁 S1 → T1 二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线 1、荧光(磷光)的激发光谱曲线与发射光谱曲线 2、激发光谱与发射光谱的关系 Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能