第一章蛋白质工程绪论.pptVIP

三、 pro工程的研究内容 1、pro的结构和功能 2、pro的结构、功能设计和预测 3、pro的结构修饰 1、pro的结构和功能 每一种pro有自己独特的aa顺序，pro功能部位的几个aa残基决定着pro的功能，这几个负责功能的aa残基必须处于一个及其精密的空间状态下才能发挥功能。这就是说，只要能维持pro结构域的必需aa及空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。所以只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能通过改变aa达到改造pro的目的。 pro分子设计按照被改造部位的多寡分为三种类型： 2、pro的结构、功能设计和预测 “大改”，即在了解pro结构和功能的基础上，从pro一级结构出发，设计自然界不存在的全新pro。 “小改”：对已知结构的pro进行几个残基的替换来改善pro的结构和功能； “中改”：对天然pro分子进行大规模地肽链或结构域替换以及对不同pro的结构域进行拼接组装； 通过物理、化学法修饰pro侧链基团、水解肽链等；生物化学法利用蛋白酶选择性分割pro，采用基因重组技术或人工合成DNA，改造蛋白，甚至合成新的pro。 3、pro的结构修饰 四、 pro工程的产生与发展 1、pro工程与其他技术相互渗透 （1）pro工程与发酵工程 发酵工程可以利用基因技术和细胞杂交技术选育出一大批生长速度快、代谢能力强、易于大量表达外源产物的新菌种，可为pro工程提供优良稳定的工程菌株，并可为pro工程中前期材料的制备等奠定重要基础。 （2）pro工程与基因工程 pro工程是从DNA水平改变基因入手，通过体外重组技术改造pro或设计合成具有特定功能新pro的新兴研究领域，也就是说pro的改造通常需要经过周密的分子设计，进而依赖基因工程获得突变型pro。目前，基因工程已为实现pro工程提供了基因克隆、表达、突变及活性检测等关键技术。 （3）pro工程与细胞工程 细胞工程是指以细胞为单位，在细胞和亚细胞水平上有目的地进行遗传操作，通过细胞融合、核移植等方法，培养出人们需要的新物种，克服了源远杂交的局限性。 目前，细胞工程技术已为pro工程提供了改良性状的微生物细胞以及稳定的动植物细胞系，以便更好的生产pro；另外，细胞工程可通过细胞融合、转基因技术改变生物的遗传性状或实现新型生物的构建，进而为pro的生产提供更多良好的载体。 （4）pro工程与酶工程 由于大部分酶的化学本质是pro，因此酶工程与pro工程的发展密不可分。 （5）pro工程与生物信息技术 利用生物信息学可以进行pro结构的预测，其目的就是利用已知的一级序列来构建pro的立体结构模型。 2、pro工程的发展简史 1926年，Sumner从刀豆中提纯了脲酶，首次证明酶的本质是pro。 1932年，英国化学家Krebs等提出合成尿素的鸟氨酸循环多酶反应途径。 1937年，Krebs公布了三羧酸循环的研究成果。 1940年，德国生化学家Embclen和Megerbof公布了糖酵解途径。随后，脂肪酸氧化和核苷酸代谢途径也相继被阐明。 同时期，我国生物化学家吴宪等提出pro变性学说。 1953年，英国生物化学家桑格破译出由17种51个aa组成的牛胰岛素两条多肽链的全部结构。 1965年，我国首先在世界上成功人工合成了具有天然生物活力的pro——结晶牛胰岛素。 1975年，O’Farrel建立了双向电泳（2-DE）技术，可以用于组织与细胞中大规模pro的分离。 20世纪80年代末期，Hillenkamp发展了激光解吸质谱，Fenn设计了电喷雾质谱，可以高效、精确地测量生物大分子的质量并测定部分序列，进而用于数据库的检测；Mann通过建立“肽指纹图谱与肽序列标签”等技术，实现了质谱准确、快速、自动化和大规模鉴定pro的飞跃。 1982年，Winter等首次报道通过基因定点诱变获得改性。 1983年，Ulmer在《Science》上发表了Protein Engineering的专论，标志着pro工程的正式诞生。 1982年~1985年，Forsht等对酪氨酰tRNA合成酶的分子进行了改造，根据X射线衍射实测该酶与底物结合部位的结构，通过定点突变技术改变与底物结合的aa残基，还用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制，这就是最早的pro工程。 1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile3改成Cys3，并进一步氧化成Cys3- Cys97二硫键，提高了酶的热稳定性，显著改进了溶菌酶在食品工业的应用价值。 1987年，Forsht将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而导致活性中心His64质子pKa从7降到6，使酶在pH=6时的