基因文库技术.pptVIP

* Leptin基因 Mice without the leptin gene are morbidly obese (right) compared to normal mice (left). 1994年，美国Rockfeller大学研究开发的肥胖相关基因Leptin 以2000万美元转让给Amgen公司。 Effects of recombinant human leptin treatment in a child with leptin deficiency. 第四章 目的基因的分离克隆 第一节 基因文库技术分离目的基因 1 基因文库的含义 文库（library）：是指一种全体的集合。 基因文库（gene library）：是指某一生物全部基因的集合。 某生物基因组DNA片段(例如10n个)与载体分子重组，重组DNA转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上长出的单个菌落（或噬菌斑）即为一个DNA片段的克隆。全部片段克隆的集合即为该生物的基因文库。 噬菌斑 菌落 2 基因文库的分类 1）基因组文库和cDNA文库 基因组文库（genomic DNA library）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。 cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。 2）克隆文库和表达文库 克隆文库由克隆载体构建。 表达文库由表达克隆载体构建。 3）不同载体的文库 （1）质粒文库 （2）噬菌体文库 （3）粘粒文库 （4）人工染色体文库 4）减法文库 减法文库又称扣除文库及精简文库。它是通过野生型DNA与缺失型DNA，或不同时空、不同环境条件的两种cDNA样品反复杂交，去除杂交体后,将剩余的DNA或cDNA片段进行克隆而构建的文库。 5）亚克隆文库 亚克隆文库是将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法(shotgun)随机小片段化，然后用这些随机小片段建立的DNA文库。 3 基因文库的构建 1）基因组文库构建的基本步骤 （1）基因组DNA的提取及片段化 （2）载体的选择和制备 （3）DNA片段与载体连接形成重组DNA （4）重组DNA转化宿主细胞 基因组文库（genomic DNA library）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。 cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。 基因文库（gene library）：是指某一生物全部基因的集合。 噬菌斑 菌落 cDNA（complementary DNA，互补DNA）： 以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的DNA。 2）cDNA文库构建的基本步骤 （1）细胞总RNA的提取并分离纯化出mRNA （2）合成cDNA的第一条链 （3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA （4）双链cDNA与载体连接形成重组DNA （5）重组DNA转化宿主细胞 5 基因文库的筛选 1）核酸杂交法 复性 DNA 核酸分子杂交的原理 ：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链。 探针 (probe) ：一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在硝酸纤维素膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 *